一种嵌合型植物腈水解酶突变体、编码基因及其应用制造技术

本分案申请公开了一种十字花科嵌合型植物腈水解酶突变体，属于生物工程技术领域。本发明专利技术将高山南芥腈水解酶氨基酸序列的225‑285位肽段嵌入到缺失对应肽段的芜菁腈水解酶中，获得芜菁/高山南芥腈水解酶嵌合体BaNIT，进而对嵌合体BaNIT的编码基因进行定点饱和突变，使得嵌合体BaNIT的第279位的Q突变为E，获得嵌合型植物腈水解酶突变体BaNIT‑Q279E。本发明专利技术提供的植物腈水解酶突变体的催化活力提高1.41倍，重组蛋白的可溶性提高，对映体选择率E值保持在400以上，在高效催化外消旋异丁基丁二腈合成(S)‑3‑氰基‑5‑甲基己酸中具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种嵌合型植物腈水解酶突变体、编码基因及其应用本申请为申请号201810765047.5、申请日2018年7月12日、专利技术名称“一种植物腈水解酶突变体、编码基因及其应用”的分案申请。
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种十字花科植物腈水解酶突变体、编码基因，及其在水解外消旋异丁基丁二腈制备普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。
技术介绍
腈类化合物是有机合成的重要中间体，可以合成酰胺、羧酸、氧肟酸等附加值更高、应用范围更广的化学品，广泛应用于化工、农药和医药等工业领域。但腈的化学水解往往需要强酸(或强碱)、高温、高压等反应条件，环境污染严重。腈水解酶生物催化具有高度的化学、区域及立体选择性，且反应条件温和、环境污染小，符合绿色可持续发展的要求，在有机化工领域具有广阔的应用前景。目前腈水解酶已成功应用于烟酸、(R)-扁桃酸和1,5-二甲基-2-哌啶酮等精细和医药化学品的工业化生产。随着现代分子生物学技术的发展以及工业生产环境对生物催化剂的需求，蛋白质分子改造已成为当前酶工程研究的热点。分子改造技本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种植物腈水解酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种植物腈水解酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。


2.一种编码如权利要求1所述的植物腈水解酶突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。


3.一种包含如权利要求2所述的编码基因的重组载体。


4.一种包含如权利要求3所述的重组载体的重组基因工程菌。


5.一种植物腈水解酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)针对芜菁腈水解酶基因序列，设计PCR引物，以高山南芥cDNA为模板，利用所述PCR引物扩增获得含有高山南芥腈水解酶核苷酸序列675-855位的DNA片段Ⅰ；
(2)以携带有芜菁腈水解酶基因的重组质粒为模板，利用反向PCR扩增获得芜菁腈水解酶核苷酸序列678-858位缺失的BrNIT质粒片段；
(3)将DNA片段Ⅰ和BrNIT质粒片段重组，再将重组产物转化至宿主菌，筛选获得重组后的亲本腈水解酶表达菌株，其中亲本腈水解酶的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
(4)设计定点突变引物，以步骤(3)获得的携带有亲本腈水解酶基因的重组质粒为模板，进行重叠延伸PCR，获得亲本腈水解酶中第279位的Q突变为E的单位点突变产物；
(5)将所述单位点突变产物转化至宿主菌，筛选获得腈水解酶突变体表达菌株，诱导表...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑仁朝，郑裕国，张琴，汤晓玲，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33