一种大肠杆菌菌影的高效制备方法技术

本发明专利技术公开了一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，步骤是：制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞；构建含有噬菌体裂解基因E

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌菌影的高效制备方法
本专利技术属于微生物学和基因工程领域，具体涉及一种大肠杆菌菌影的高效制备方法。
技术介绍
菌影(Bacterialghost)是不含核酸、蛋白质等细胞内容物的完整细菌空壳，菌影保留了细胞壁表面和内膜结构的完整性，其表面的脂多糖等可以作为抗原有效的刺激机体发生体液免疫、细胞免疫以及局部黏膜免疫应答。除此之外，不含细胞内容物的菌影也是良好的递承载体及疫苗佐剂，可以装载大量药物、核酸、抗原等物质，具有良好的应用前景。菌影是通过在革兰氏阴性细菌中诱导表达噬菌体裂解基因E的方式制备形成。基因E的裂解功能是在1966年在噬菌体感染大肠杆菌中的一次实验中发现的，之后的研究证明基因E在大肠杆菌中的唯一表达就可以引起大肠杆菌的后续裂解。研究表明，基因E编码一种含91个氨基酸的膜蛋白，其N端的疏水性氨基酸能插入到多种革兰氏阴性菌的细胞膜和细胞壁上，聚集形成40-200nm的特异性跨膜通道。在高/低渗透压的作用下，细胞内容物则通过该特异性通道排出。在电镜下观察，发现E蛋白介导的特异性通道并非在细胞膜上随机分布，而是有规律的集中在细菌细胞的两端或中间。大肠杆菌BL21(DE3)是使用最广的用于高效表达目的基因的菌株，目的基因被克隆到含有噬菌体T7启动子的载体上，T7启动子由T7RNA聚合酶识别并调节。调控T7RNA聚合酶的基因位于染色体上，由lacUV5启动子调控。裂解基因E编码产生的裂解蛋白是一种膜蛋白，研究表明，膜蛋白的过量表达会对宿主菌产生毒性作用，因此影响菌影制备的产量。在众多研究中，许多研究者将裂解基因E克隆在pBV220等其他温控载体，然而，其表达产生的菌影产量低一直是困扰研究者的一个问题。
技术实现思路
本专利技术旨在解决传统制备方法产量低的不足，提供一种大肠杆菌菌影的高效制备方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，包括以下步骤：(1)制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞；(2)构建含有噬菌体裂解基因EW及其突变型裂解基因EM的重组表达质粒pET21a-EW和pET21a-EM，再将上述重组质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞中，以氯霉素和氨苄青霉素为抗性筛选，得到重组大肠杆菌；(3)将步骤(2)得到的重组大肠杆菌加到含100μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃、220rpm下震荡培养；次日按体积比1：100转接到新鲜的LB培养基中，加入诱导剂IPTG诱导菌体裂解；(4)利用平板计数法进行裂解前后的活菌计数，检测裂解效率最高达99.99％时，收集菌影；(5)将收集的菌影洗涤、乙醇逐级脱水、临界点干燥，用场发射扫描电子显微镜观察；(6)将收集的菌影洗涤，再用3％磷钨酸染色，透射电子显微镜观察。优选的，步骤(1)中，采用氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞。更优选的，步骤(1)中，所述大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞的制备方法如下：挑取大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌单菌落，接种于5mL含30μg/mL氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃震荡培养14h；取2mL种子液加入100mL新鲜LB培养基，扩大培养2-3h，测OD600的值，当OD600约0.4-0.5时停止培养；菌液冰上放置30min，无菌条件下移入50ml离心管中，4℃、4000rpm离心10min；弃上清，在冰上加入8mL预冷的无菌CaCl2轻摇使细菌悬浮，冰浴30min；4℃、3500rpm离心5min，弃上清，用1ml预冷的无菌CaCl2重浮细菌，分装到预冷的无菌EP管中，每管100μL，-80℃保存备用。优选的，步骤(2)中，所述重组质粒pET21a-EW和pET21a-EM的构建方法如下：(2.1)从NCBI上下载得到噬菌体裂解基因E，即野生型裂解基因EW；根据密码子的偏好性以及二级结构的筛选，同时将第89位精氨酸突变成谷氨酰胺得到突变型裂解基因EM；根据裂解基因EW和EM以及质粒pET21a的序列，结合RF克隆的方法，设计上下游引物，引物序列如下：(2.2)配制PCR体系，以合成的EW和EM基因为模板进行基因扩增，PCR体系及程序如下：取3μLPCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶中进行电泳分析；再用通用型DNA纯化回收试剂盒回收上述PCR产物，得到目的基因；采用RF线性扩增的方式以pET21a质粒为模板，以上述回收的PCR产物为引物进行线性扩增，配置的PCR反应体系如下：线性扩增反应完成后，用DpnI酶消化体系中未甲基化的模板质粒，程序如下：体系配置完成后，在37℃条件下，酶切1h；(2.3)将反应完成的产物立即采用热激法转化到大肠杆菌DH5α感受态中，以氨苄青霉素抗性筛选；次日，挑取大小均匀的淡黄色菌落经PCR扩增后，将阳性克隆子送至生工生物(上海)有限公司测序；经过序列比对，正确的阳性克隆质粒即为构建成功的重组质粒，命名为pET21a-EW和pET21a-EM。优选的，步骤(2.3)中，将产物转化至DH5α感受态细胞时采用的转化方法为热激法。优选的，步骤(2)中，将重组质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞时采用的转化方法为热激法。优选的，步骤(3)中，诱导菌体裂解的步骤是：取1％的种子液到新鲜培养液中，37℃、220rpm培养；当OD600达到2.0时，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，每30min取样，测定OD600值，直到OD600值趋于平稳。优选的，步骤(5)中，电镜观察到裂解后细菌仍然保留原有形态结构，在赤道和两极形成十分明显的孔道，即为大肠杆菌菌影。优选的，步骤(6)中，电镜观察到裂解后细菌呈现浅色透明状态，即为不含内容物的菌影。与现有技术相比，本专利技术提供了一种可以高效制备菌影的大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)pLysS。BL21(DE3)pLysS菌株是BL21(DE3)的衍生菌株，该菌株同样为T7可控表达菌株，专为表达膜蛋白及问题蛋白设计而成。目的基因的表达依赖于T7RNA聚合酶的活性，BL21(DE3)pLysS中含有一个可以编码T7溶菌酶(lysozyme，lys)的质粒pLysS。该质粒含有T7噬菌体基因3.5，其基因在T7RNA聚合酶弱启动子Φ3.8调控下产生T7溶菌酶。T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的天然抑制剂，可以调控目的基因的过表达及泄漏表达。本专利技术以BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS为宿主菌，相比较而言，BL21(DE3)pLysS极大地提高了菌影的产量，当OD600值达到2.0时，其CFU值为1012/ml，用IPTG诱导后，OD600值降低到0.4，其相应的最终活菌数CFU值为105/ml。本专利技术制备得到的菌影数量大大提高，为大规模发酵生产菌影提供新策略。附图说明图1为含有裂解基因的重组菌落P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞；/n(2)构建含有噬菌体裂解基因E

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞；
(2)构建含有噬菌体裂解基因EW及其突变型裂解基因EM的重组质粒pET21a-EW和pET21a-EM，再将上述重组质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞中，以氯霉素和氨苄青霉素为抗性筛选，得到重组大肠杆菌；
(3)将步骤(2)得到的重组大肠杆菌加到含100μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃、220rpm下震荡培养；次日按体积比1：100转接到新鲜的LB培养基中，加入诱导剂IPTG诱导菌体裂解；
(4)利用平板计数法进行裂解前后的活菌计数，检测裂解效率最高达99.99％时，收集菌影；
(5)将收集的菌影洗涤、乙醇逐级脱水、临界点干燥，用场发射扫描电子显微镜观察；
(6)将收集的菌影洗涤、磷钨酸染色，透射电子显微镜观察。


2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，其特征在于，步骤(1)中，采用氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞。


3.根据权利要求2所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，其特征在于，步骤(1)中，采用氯化钙法制备大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞的步骤是：挑取大肠杆菌BL21(DE3)pLysS单菌落，接种于5mL含30μg/mL氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃震荡培养14h；取2mL种子液加入100mL新鲜LB培养基，扩大培养2-3h，测OD600的值，当OD600约0.4-0.5时停止培养；菌液冰上放置30min，无菌条件下移入预冷的50ml离心管中，4℃、4000rpm离心10min；弃上清，在冰上加入8mL预冷的无菌CaCl2轻摇使细菌悬浮，冰浴30min；4℃、3500rpm离心5min，弃上清，用1mL预冷的无菌CaCl2重浮细菌，分装到预冷的无菌EP管中，每管100μL，-80℃保存备用。


4.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌菌影的高效制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述重组质粒pET21a-EW和pET21a-EM的构建方法如下：
(2.1)从NCBI上下载得到噬菌体裂解基因E，即野生型...

【专利技术属性】
技术研发人员：马毅，崔柳，王菊芳，陈瑞，
申请(专利权)人：华南理工大学，深圳百纳心致生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44