一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法及装置和应用制造方法及图纸

本发明专利技术提供了一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法及装置和应用，该方法主要包括：先利用高孔隙率精准微孔滤膜对样本中的背景细胞和稀有目标细胞分别实现初次高效率去除与回收；再利用与背景细胞特异结合的免疫磁珠对背景细胞进行再次去除；最后，再次利用微孔滤膜对稀有目标细胞进行回收和富集。本发明专利技术提供的“先滤膜过滤，再磁珠负选”的方法，在实现背景细胞最大限度去除，保证稀有目标细胞高细胞活性、高体积通量、高灵敏度、高纯度分离与富集的同时，降低了免疫磁珠用量及经济成本。因此，本发明专利技术提供的方法，不仅操作流程简单、集成度高，避免了离心、液体转移等造成的细胞活性降低；而且经济成本低、装置便携，应用范围广、潜能大。

【技术实现步骤摘要】
一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法及装置和应用
本专利技术涉及生物医学基础研究及临床医学领域，特别是涉及一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法及装置和应用。
技术介绍
恶性肿瘤是危害人类健康的重大医学问题，2015年中国恶性肿瘤流行情况分析指出，我国平均每分钟有7人被诊断为肿瘤，4人死于肿瘤。近年来，液体活检已发展成为癌症精准医疗的关键技术之一。从液体中分离富集稀有细胞的液体活检技术在癌症早期检测和动态预后监测中具有巨大的应用前景。液体活检方法主要可分为基于物理性质分离和基于生物亲和性分离两类。基于物理性质的稀有目标细胞分离方法可以保留稀有目标细胞的异质性，并且能够实现全部稀有目标细胞的富集。其中，基于尺寸分离的微孔过滤法已被公认为有望实现高通量分离，满足处理实际临床样品需求。然而，由于稀有目标细胞与其他血细胞在尺寸上有一定重叠，使得通过微孔过滤法富集液体中稀有目标细胞纯度较低。目前，逐渐有研究者将基于生物亲和性分离和尺寸分离相结合，通过复合方式扬长避短，提高稀有目标细胞的分离富集效果。如在专利CN104178454A分离富循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell，CTC)过程中，先通过免疫磁珠法去除大部分白细胞，再基于尺寸进行过滤式富集。该方法虽然提高了富集效率(富集效率>80％)，对白细胞的去除效率>99.9％，但由于血液中白细胞数量(～107/mL)相对于CTC(1～10/mL)较多，导致最终得到的CTC悬液纯度依然较低。假设5mL血液样本中含有5×107个白细胞，50个CTCs，通过上述方法进行CTC富集后即使白细胞去除效率>99.9％，相较于50个CTCs，最终CTC悬液中白细胞(5×104)残留较多，阻碍对细胞提出高细胞活性和高纯度要求的下游分析。同时，由于血液中白细胞数量较多，富集过程中需消耗大量生物亲和性磁珠，经济成本高，在实际应用中仍有很大局限。稀有细胞的单细胞组学分析、肿瘤类器官培养及药物耐药性分析等近年来发展迅速。从复杂液体样品中高效地分离、富集稀有目标细胞是下游平台精准检测和分析的关键前提。与传统分离方法(连续稀释法、显微操作法、激光捕获显微切割术、拉曼镊技术、微流控技术、荧光激活细胞分选术)相比，通过先进微纳米技术分离与富集得到的稀有细胞有望实现高细胞活性、高通量、高灵敏度、高纯度等优点，满足下游单细胞组学分析对样品的要求。以单细胞转录组测序为例，细胞纯度和活性是保证分析质量的关键。综上，亟需一种高细胞活性、高体积通量、高灵敏度、高纯度、强普适性、低成本的稀有目标细胞分离与富集方法。
技术实现思路
为解决上述
技术介绍
中存在的问题，本专利技术提供了一种高细胞活性稀有目标细胞分离与富集的方法，该方法将基于物理尺寸差异分离的微孔滤膜法和基于生物亲和性的免疫磁珠负选法进行综合，并基于微孔滤膜法对提纯后的稀有目标细胞进行富集，通过该方法可实现对稀有目标细胞的高细胞活性、高体积通量、高灵敏度、高纯度、强普适性、低成本的分离与富集。其中，本专利技术将高孔隙率精准微孔滤膜过滤与磁珠负选法结合，综合两者的优势，采用高孔隙率精准微孔滤膜对稀有目标细胞进行初级回收的同时，去除大量的背景细胞是本专利区别于已有专利的核心优势，具体如下：一方面，提高了后续免疫磁珠负选的效率，使背景细胞被最大限度地去除，实现了稀有目标细胞的高体积通量、高纯度分离与富集；另一方面，降低免疫磁珠使用量，从而降低经济成本，扩大了本专利技术的应用范围和转化潜能。同时，本专利技术提供的方法，采用免疫磁珠负选能够将具有生化异质性的所有亚型目标细胞全部分离与富集，保证了稀有目标细胞分离与富集的灵敏度；且操作对稀有细胞不会有损伤，保证了稀有细胞的活性。并且，本专利技术提供的方法，操作流程简单、集成度高，避免了离心、液体转移等造成细胞回收灵敏度和活性被降低，再次保证了稀有目标细胞分离与富集的高细胞活性、高灵敏度。第一方面，本专利技术提供了一种高细胞活性稀有目标细胞分离与富集的方法，所述方法包括：步骤1，通过表面功能化修饰的微孔滤膜，对复杂液体样品进行分离，使得稀有目标细胞被俘获于微孔滤膜；所述复杂液体样品包括稀有目标细胞和背景细胞；步骤2，激活俘获有稀有目标细胞的微孔滤膜的表面功能化修饰层，使得所述微孔滤膜上的稀有目标细胞被释放/回收到预处理后的低吸附样品管中，得到初级稀有目标细胞悬液；步骤3，基于生物亲和性原理去除所述初级稀有目标细胞悬液中混有的背景细胞，得到次级稀有目标细胞悬液；步骤4，通过所述表面功能化修饰的微孔滤膜，对所述次级稀有目标细胞悬液中的稀有目标细胞进行回收、释放与富集，得到稀有目标细胞悬液。可选地，所述表面功能化修饰的微孔滤膜包括微孔滤膜基体和表面功能修饰剂；所述表面功能修饰剂附着在所述微孔滤膜基体的表面。可选地，制备所述微孔滤膜基体的材料包括聚对二甲苯、硅、氮化硅、钯、SU8和聚二甲基硅氧烷中的任意一种；所述表面功能修饰剂为具有生物兼容性好、易于可控切换的材料，包括聚乙烯醇、海藻酸凝胶、明胶、胶原中的任意一种；其中，所述可控切换是指结构或性能可切换，包括聚合大分子溶解成小分子、固态相变为液态、亲水性切换成疏水性中的任意一种或多种。可选地，所述表面功能化修饰的微孔滤膜的膜孔的形状包括：正六边形、圆形、正四边形、正三边形中的任意一种；所述表面功能化修饰的微孔滤膜的膜孔的直径，根据所述稀有目标细胞的直径确定；相邻膜孔间的连接部分的最大距离小于所述背景细胞直径的一半。可选地，所述表面功能化修饰的微孔滤膜，是按照以下步骤获得的：步骤S11，通过表面功能修饰剂溶液润湿载破片，并将微孔滤膜基体放置于所述润湿后的载玻片上；步骤S12，通过旋涂的方式，在所述微孔滤膜基体的表面，覆盖所述表面功能修饰剂溶液，得到表面功能化修饰的微孔滤膜初品；步骤S13，室温晾干所述微孔滤膜初品，得到表面功能化修饰的微孔滤膜。可选地，在所述步骤2之前，所述方法还包括：对用于存放所述稀有目标细胞悬液的样品管进行预处理；所述预处理包括：基于低吸附处理试剂，对所述样品管的内壁进行表面低吸附处理。其中，所述低吸附处理试剂包括：全氟辛基三氯硅烷、牛血清白蛋白、聚乙二醇、聚乙烯醇中的任意一种；可选地，所述基于生物亲和性原理去除所述初级稀有目标细胞悬液中的背景细胞，包括：通过具有生物亲和性的免疫磁珠，进一步去除所述初级稀有目标细胞悬液中的背景细胞；其中，所述生物亲和性的免疫磁珠是指：偶联有与所述背景细胞进行特异性结合的生物亲和性分子的免疫磁珠；所述生物亲和性分子包括抗体、核酸适配体中的一种或多种。可选地，所述复杂液体样品包括：人或动物的血液、尿液、肺泡灌洗液、胸水、腹水、脑脊液或痰液中的任意一种；所述复杂液体样品中的稀有目标细胞包括：肿瘤细胞、上皮细胞、巨噬细胞、胞外囊泡、细菌或真菌中的任意一种。第二方面，本专利技术提供了一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的装置，所述装本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法，其特征在于，所述方法包括：/n步骤1，通过表面功能化修饰的微孔滤膜，对复杂液体样品进行分离，使得稀有目标细胞被俘获于微孔滤膜；所述复杂液体样品包括稀有目标细胞和背景细胞；/n步骤2，激活俘获有稀有目标细胞的微孔滤膜的表面功能化修饰层，使得所述微孔滤膜上的稀有目标细胞被释放/回收到预处理后的低吸附样品管中，得到初级稀有目标细胞悬液；/n步骤3，基于生物亲和性原理负选去除所述初级稀有目标细胞悬液中混有的背景细胞，得到次级稀有目标细胞悬液；/n步骤4，通过所述表面功能化修饰的微孔滤膜，对所述次级稀有目标细胞悬液中的稀有目标细胞进行回收、富集与释放，得到稀有目标细胞悬液。/n

【技术特征摘要】
1.一种高细胞活性稀有细胞分离与富集的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1，通过表面功能化修饰的微孔滤膜，对复杂液体样品进行分离，使得稀有目标细胞被俘获于微孔滤膜；所述复杂液体样品包括稀有目标细胞和背景细胞；
步骤2，激活俘获有稀有目标细胞的微孔滤膜的表面功能化修饰层，使得所述微孔滤膜上的稀有目标细胞被释放/回收到预处理后的低吸附样品管中，得到初级稀有目标细胞悬液；
步骤3，基于生物亲和性原理负选去除所述初级稀有目标细胞悬液中混有的背景细胞，得到次级稀有目标细胞悬液；
步骤4，通过所述表面功能化修饰的微孔滤膜，对所述次级稀有目标细胞悬液中的稀有目标细胞进行回收、富集与释放，得到稀有目标细胞悬液。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面功能化修饰的微孔滤膜包括微孔滤膜基体和表面功能修饰剂；
所述表面功能修饰剂附着在所述微孔滤膜基体的表面。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，制备所述微孔滤膜基体的材料包括聚对二甲苯、硅、氮化硅、钯、SU8和聚二甲基硅氧烷中的任意一种；
所述表面功能修饰剂为具有生物兼容性好、易于可控切换的材料，包括聚乙烯醇、海藻酸凝胶、明胶、胶原中的任意一种；其中，所述可控切换是指结构或性能可切换，包括聚合大分子溶解成小分子、固态相变为液态、亲水性切换成疏水性中的任意一种或多种。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面功能化修饰的微孔滤膜的膜孔的形状包括：正六边形、圆形、正四边形、正三边形中的任意一种；
所述表面功能化修饰的微孔滤膜的膜孔的直径，根据所述稀有目标细胞的直径确定；相邻膜孔间的连接部分的最大距离小于所述背景细胞直径的一半。


5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于，所述表面功能化修饰的微孔滤膜，是按照以下步骤获得的：
步骤S11，通过表面功能修饰剂溶液润湿载破片，并将微孔滤膜基体放置于所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玮，刘姚萍，许清梅，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11