塞尼卡谷病毒3D蛋白作为免疫诱导剂或者佐剂的应用制造技术

本发明专利技术属于病毒免疫学领域，尤其是涉及SVA的3D蛋白的新功能，如：3D蛋白可作为NLRP3介导的炎症信号转导激活剂进行应用，3D蛋白激活了IL‑1β的产生和分泌。同时发现了3D蛋白通过其N端1～154aa与NLRP3的NATCH结构域相互作用，并以调控钙离子和钾离子的细胞内的浓度变化方式激活细胞内NLRP3炎症小体介导的IL‑1β的产生和分泌。本发明专利技术为为SVA的防控以及3D蛋白可以作为佐剂激活炎症反应提供了新的靶点和理论支持。

【技术实现步骤摘要】
塞尼卡谷病毒3D蛋白作为免疫诱导剂或者佐剂的应用
本专利技术属于生物
和病毒免疫学领域，尤其是涉及SVA（SenecavirusA）的蛋白3D的新功能，即SVA3D蛋白可以诱导IL-1β的分泌，最终导致SVA病毒复制降低，起到促进免疫反应的作用。
技术介绍
炎症是身体自然愈合过程的一部分，但是当它变成慢性时，它会导致癌症、阿尔茨海默病和其他疾病。在对细胞应激、组织损伤或传染性病原体产生的不同信号作出反应时，炎性体（inflammasome）触发炎症产生。白介素1（IL-1β）是一种炎性细胞因子或激素，是分泌蛋白，通常由巨噬细胞产生，在宿主抗病毒免疫应答过程中发挥关键作用。炎症的有益影响和不利影响都是由IL-1β引发的。在正常情形下，IL-1β以非常低的数量产生，但是当对组织损伤、环境应激、感染或慢性炎症作出反应时，IL-1β的产生高度地增加。IL-1β的分泌可以促进大量的急性蛋白表达，同时也参与机体局部的免疫调节作用，如促进B细胞的生长和分化以及抗体的形成；促进单核细胞的抗原递呈能力等，以IL-1β通路为靶标的治疗已成功地应用于许多病毒感染的临床治疗，如在治疗干眼病的过程中，通过局部敷用靶向IL-1的拮抗剂药物可显著的降低干眼病的相关症状以及眼表疾病；临床还可以通过抑制IL-1途径治疗痛风。IL-1β在病毒诱导应答过程中，机体受到病毒刺激应答，通过模式识别受体信号通路激活NF-κB信号通路，导致IL-1β前体的产生，此为信号1；同时病毒诱导炎症小体活化，如NLRP3炎症小体活化，活化过程包括NLRP3与ASC形成复合体，然后结合Caspase1的前体，并使其形成成熟的Caspase1，成熟的Caspase1对IL-1β前体进行切割，最终形成成熟的IL-1β并分泌至胞外，产生炎症反应。为了对抗宿主适度的免疫防御，病毒获得了无数的策略，其中之一就是针对IL-1β产生的信号通路，包括抑制炎症小体活化以及激活炎性小体使得其过度活化。例如，脊髓灰质炎病毒（EV71）的基因组能够活化NLRP3诱导的IL-1β的分泌。寨卡病毒（Zika）的NS5作为非结构蛋白能够通过结合NLRP3的LRRs和NACHT结构域激活NLRP3炎症小体。EMCV的2B蛋白也参与激活NLRP3炎症小体介导的IL-1β的分泌。许多病毒蛋白也同样抑制NLRP3炎症小体的活化，如流感病毒的NS1蛋白利用其N端结构抑制IL-1β以及IL-18的表达。麻疹病毒V蛋白结合NLRP3的C端，进而阻止NLRP3介导的IL-1β的分泌。EV71的2A和3C蛋白通过降解NLRP3抑制IL-1β的表达。塞内卡病毒病是由A型塞内卡病毒引起的动物传染病，主要感染猪，对不同年龄阶段的猪都易感。在2015年初，巴西、泰国和中国首次暴发了由塞内卡病毒引起的水疱性疾病。同年，研究发现病毒感染与新生仔猪死亡率相关。SVA属于RNA病毒科（Picornaviridae），SVA具有小RNA病毒基因组的典型特征，其基因组RNA由大约7200个核苷酸（nt）组成。该病毒基因组仅有一个开放阅读框（openreadingframes，ORF），编码约2180个氨基酸的多聚蛋白。由先导蛋白（L）、P1（裂解VP1、VP2、VP3和VP4四种结构蛋白）、P2（裂解为2A、2B和2C三种非结构蛋白）、P3（裂解成3A、3B、3C和3D四种非结构蛋白）组成。3D蛋白是SVA的一个重要病毒蛋白，为病毒聚合酶。同时3D蛋白也参与结合宿主因子，但研究较少，如同科SVA的3D蛋白能够与宿主因子相互作用如Sam68、DDX1等，其具体的机制不清楚，SVA3D蛋白的参与免疫和炎症反应的研究目前是空白。
技术实现思路
本专利技术揭示SVA的3D蛋白的新功能，即3D蛋白首先活化NF-κB的磷酸化，进而通过改变细胞内的钙离子和钾离子浓度以及结合NLRP3的NACHT结构域激活NLRP3炎症小体，最终导致IL-1β的成熟与分泌降解。本专利技术构建的3D蛋白的慢病毒表达系统，接种小鼠后，发现IL-1β的分泌和产生显著增加，7天后，小鼠死亡，不同的小鼠组织显示充血、肿大。结果表明，过度的3D蛋白能够诱导炎症的发生并且导致器官损伤。同时，将相同剂量的该慢病毒系统接种宿主动物（猪，90日龄），动物组织没有出现明显病变，然而IL-1β的表达量显著上升。表明低剂量的3D也能诱导炎症反应。本专利技术为控制病毒诱导炎症反应，设计3D的抑制药物提供新的视角，同时在疫苗设计中，为促进机体免疫应答，SVA3D蛋白作为诱导剂或者佐剂使用，帮助更好产生抗体做理论铺垫。其中，3D蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术构建3D基因慢病毒表达系统，构建策略如下：（1）以SVA病毒为模板，用引物1F和2R扩增含有3D基因的片段，与pMD20T载体连接，获得阳性克隆PMD-3D，送华大基因测序，显示正确；其中扩增含有3D基因的引物：1F：5'-ataggtttaattaatgttaagcgtctg-3'（SEQIDNO:2）；1R：5'-gtctgtggatccctcgttggagcc-3'（SEQIDNO:3）；（2）将PMD-3D进行双酶切，连接到慢病毒载体（pHBLV-Zsgreen-puro）；（3）将慢病毒载体进行病毒包装，收获r-lenti-3D。空载体的慢病毒（empty-lenti）包装同3D基因过表达慢病毒包装策略相同。SVA的3D蛋白通过其N端（1～154aa）与NLRP3的NATCH结构域结合，并通过改变细胞内的钾离子和钙离子的浓度激活NLRP3炎症小体介导的IL-1β的产生和分泌，具体鉴定过程如下：（1）SVA的3D基因和其他相关基因如3D-12(△309-463aa)、3D-13(△154-309aa)、3D-23(△1-154aa)、NATCH、NLRP3、PYD、LRR、pro-Caspase-1、pro-IL-1β、ASC等重组质粒的构建；其中，3D基因的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示，3D-12(△309-463aa)、3D-13(△154-309aa)、3D-23(△1-154aa)、NLRP3、pro-Caspase-1、pro-IL-1β、ASC基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO:5～11所示。（2）3D以及3D缺失突变体flag-3D-12(△309～463aa)、flag-3D-13(△154～309aa)、flag-3D-23(△1～154aa)基因重组载体分别与空载体、NLRP3、PYD、LRR、或pro-Caspase-1、pro-IL-1β、ASC等共转染，并且部分结果中使用不同的信号通路激活或抑制剂或标记物进行处理，这些激活剂或抑制剂或标记物的作用路径不同。（3）根据激活剂或抑制剂或标记物的作用途径来判断3D蛋白激活NLRP3的作用方式：3D通过改变细胞内的钙离子和钾离子的浓度变化激活NLRP3炎症小体。这是SVA3D的新功能。本专利技术发现在小鼠体内，3D蛋白过表达后，小鼠7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.SVA 3D蛋白在制备免疫应答诱导剂或佐剂中的应用，其特征在于，3D蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.SVA3D蛋白在制备免疫应答诱导剂或佐剂中的应用，其特征在于，3D蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。


2.SVA3D蛋白在制备IL-1β的激活剂中的应用，其特征在于，3D蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。


3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，3D蛋白通过激活宿主细胞的NLRP3炎症小体诱导IL-1β产生。


4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，3D蛋白通过诱导NF-κB的活化激活NLRP3炎症小体。


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【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，马旭升，莫希丁·乔杜里，曾宗波，曹伟军，罗志宽，朱紫祥，杨帆，张克山，田宏，党文，冯涛，王琦，刘会胜，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62