一种牦牛冷冻精液稀释液及其制备方法技术

本发明专利技术涉及种牦牛冷冻精液稀释液及其制备方法，属于生物工程技术领域。该冷冻精液稀释液包括肉苁蓉提取液、仙茅提取液、芡实液、柠檬酸钠、葡萄糖、棉籽糖、白藜芦醇、谷氨酸二乙酸四钠、玉米低聚肽等组分。本发明专利技术引入肉苁蓉提取液仙茅提取液、芡实液来维持精子活性，以白藜芦醇为抗氧化剂、谷氨酸二乙酸四钠为螯合剂，用棉籽糖保证细胞膜保护功能，制得的牦牛冷冻精液稀释液可以明显提高精子冻后活率、顶体完整率，提高了精子冻后品质，且由于无动物源成分，所以不会产生传染或引起疾病的风险，易于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种牦牛冷冻精液稀释液及其制备方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种牦牛冷冻精液稀释液及其制备方法。
技术介绍
牦牛（学名：Bosmutus或Bosgrunniens，英文名称：wildyak），属于哺乳纲、真兽亚纲、偶蹄目、反刍亚目、牛科、牛亚科动物，是以中国青藏高原为中心，及其毗邻高山、亚高山高寒地区的特有珍稀牛种之一，草食性反刍家畜。牦牛能适应高寒气候，是世界上生活在海拔最高处的（除人类外）哺乳动物，分布于中国青藏高原海拔3000米以上地区。牦牛的藏语叫雅客，世界通称为“yak”，即藏语译音。牦牛叫声像猪鸣，所以又称猪声牛。西方国家因其主产于中国青藏高原藏族地区，也称西藏牛。牦牛尾如马尾，所以又名马尾牛。精液冷冻保存是将精液用含特殊冷冻保护剂和营养成分等的稀释液稀释后，保存于液氮或干冰中，以达到在体外长期保存精子的目的。精液在经过超低温冷冻解冻后，精子的活力降低、死亡数量与畸形率增加，其原因是精子受冷打击致使精子质膜结构发生改变，严重影响质膜的完整性及其复苏后的精子的活力及受精能力。目前，冷冻精液时需要在稀释液中加入冷冻保护剂、营养物质、盐、抗生素等成分，最常用的非渗透冷冻保护剂为卵黄，例如专利申请200510096117.5、202010744351.9等，卵黄虽然有长期的使用经验和较好的保护效果，但一方面其有机成分复杂，效果不稳定且不易制成商用成品，另一方面由于其为动物源性成分，有潜在的疾病传播风险。同时，由于卵黄中存在较多的脂类，在应用中存在黏度过大、蛋黄脂肪颗粒大而不均匀，影响精子运动速率的问题，且不利于冷冻解冻后的观察与操作等问题。因此如何克服现有技术的不足是目前生物工程
亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种牦牛冷冻精液稀释液及其制备方法，该冷冻精液稀释液不采用卵黄，无动物源成分，无传染或引起疾病的风险，可以明显提高精子冻后活率、顶体完整率，提高了精子冻后品质。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种牦牛冷冻精液稀释液的制备方法，包括如下步骤：步骤（1），采用双蒸水室温超声提取肉苁蓉，得到肉苁蓉提取液；双蒸水与肉苁蓉的质量比为100：1-5；步骤（2），将仙茅粉碎至粒径不超过2mm，然后采用双蒸水于45-60℃下浸提仙茅粉碎物，得到仙茅提取液；双蒸水与仙茅的质量比为500：2-7；步骤（3），将芡实浸泡过夜后，用双蒸水磨浆，过滤，滤液用双蒸水调整至密度为1.12±0.03g/cm3，得到芡实液；步骤（4），取步骤（1）得到的肉苁蓉提取液、步骤（2）得到的仙茅提取液、步骤（3）得到的芡实液、柠檬酸钠、葡萄糖、棉籽糖、白藜芦醇、谷氨酸二乙酸四钠、玉米低聚肽、二十二碳六烯酸、双蒸水一起混匀后，静置，过滤，再向滤液中加入青霉素和链霉素，混匀，采用双蒸水补足，即得到牦牛冷冻精液稀释液；所述的牦牛冷冻精液稀释液pH值在6.8-7.2；配制每100毫升冷冻稀释液中采用的物质如下：肉苁蓉提取液0.1-0.2mL、步骤（2）得到的仙茅提取液0.1-0.2mL、步骤（3）得到的芡实液0.1-0.2mL、柠檬酸钠1.3-1.5g、葡萄糖1.8-2.2g、棉籽糖0.1-0.15g、白藜芦醇0.002-0.005g、谷氨酸二乙酸四钠0.3-0.5g、玉米低聚肽1-2g、二十二碳六烯酸1-1.5g；以双蒸水为溶剂；每100毫升冷冻稀释液青霉素和链霉素的含量均为10万国际单位。进一步，优选的是，步骤（1）中，超声提取时间为30-60min。进一步，优选的是，步骤（2）中，浸提时间为6-8h。进一步，优选的是，步骤（3）中，芡实采用30-40℃的双蒸水浸泡。进一步，优选的是，步骤（4）中，静置时间为10-20min。进一步，优选的是，步骤（4）中，过滤采用0.45μm膜过滤。本专利技术同时提供上述牦牛冷冻精液稀释液的制备方法制得的牦牛冷冻精液稀释液。本专利技术中步骤（3）芡实液制备过程中，双蒸水用量不做具体限制，只要满足最终密度为1.12±0.03g/cm3即可。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：本专利技术引入肉苁蓉提取液仙茅提取液、芡实液来维持精子活性，以白藜芦醇为抗氧化剂、谷氨酸二乙酸四钠为螯合剂，用棉籽糖保证细胞膜保护功能，制得的牦牛冷冻精液稀释液可以明显提高精子冻后活率、顶体完整率，提高了精子冻后品质，且由于无动物源成分，所以不会产生传染或引起疾病的风险，易于推广应用。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。本专利技术所述的肉苁蓉、仙茅、芡实均为普通市售干制品。实施例1一种牦牛冷冻精液稀释液的制备方法，包括如下步骤：步骤（1），采用双蒸水室温超声提取肉苁蓉，得到肉苁蓉提取液；双蒸水与肉苁蓉的质量比为100：3；步骤（2），将仙茅粉碎至粒径不超过2mm，然后采用双蒸水于50℃下浸提仙茅粉碎物，得到仙茅提取液；双蒸水与仙茅的质量比为500：5；步骤（3），将芡实浸泡过夜后，用双蒸水磨浆，过滤，滤液用双蒸水调整至密度为1.12±0.03g/cm3，得到芡实液；步骤（4），取步骤（1）得到的肉苁蓉提取液、步骤（2）得到的仙茅提取液、步骤（3）得到的芡实液、柠檬酸钠、葡萄糖、棉籽糖、白藜芦醇、谷氨酸二乙酸四钠、玉米低聚肽、二十二碳六烯酸、双蒸水一起混匀后，静置，过滤，再向滤液中加入青霉素和链霉素，混匀，采用双蒸水补足，即得到牦牛冷冻精液稀释液；所述的牦牛冷冻精液稀释液pH值在6.8-7.2；配制每100毫升冷冻稀释液中采用的物质如下：肉苁蓉提取液0.15mL、步骤（2）得到的仙茅提取液0.18mL、步骤（3）得到的芡实液0.13mL、柠檬酸钠1.4g、葡萄糖2.0g、棉籽糖0.13g、白藜芦醇0.004g、谷氨酸二乙酸四钠0.4g、玉米低聚肽1.5g、二十二碳六烯酸1.2g；以双蒸水为溶剂；每100毫升冷冻稀释液青霉素和链霉素的含量均为10万国际单位。实施例2一种牦牛冷冻精液稀释液的制备方法，包括如下步骤：步骤（1），采用双蒸水室温超声提取肉苁蓉，得到肉苁蓉提取液；双蒸水与肉苁蓉的质量比为100：1；步骤（2），将仙茅粉碎至粒径不超过2mm，然后采用双蒸水于45℃下浸提仙茅粉碎物，得到仙茅提取液；双蒸水与仙茅的质量比为500：2；步骤（3），将芡实浸泡过夜后，用双蒸水磨浆，过滤，滤液用双蒸水调整至密度为1.12±0.03g/cm3，得到芡实液；步骤（4），取步骤（1）得到的肉苁蓉提取液、步骤（2）得到的仙茅提取液、步骤（3）得到的芡实液、柠檬酸钠、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牦牛冷冻精液稀释液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤（1），采用双蒸水室温超声提取肉苁蓉，得到肉苁蓉提取液；双蒸水与肉苁蓉的质量比为100：1-5；/n步骤（2），将仙茅粉碎至粒径不超过2mm，然后采用双蒸水于45-60℃下浸提仙茅粉碎物，得到仙茅提取液；双蒸水与仙茅的质量比为500：2-7；/n步骤（3），将芡实浸泡过夜后，用双蒸水磨浆，过滤，滤液用双蒸水调整至密度为1.12±0.03g/cm

【技术特征摘要】
1.一种牦牛冷冻精液稀释液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），采用双蒸水室温超声提取肉苁蓉，得到肉苁蓉提取液；双蒸水与肉苁蓉的质量比为100：1-5；
步骤（2），将仙茅粉碎至粒径不超过2mm，然后采用双蒸水于45-60℃下浸提仙茅粉碎物，得到仙茅提取液；双蒸水与仙茅的质量比为500：2-7；
步骤（3），将芡实浸泡过夜后，用双蒸水磨浆，过滤，滤液用双蒸水调整至密度为1.12±0.03g/cm3，得到芡实液；
步骤（4），取步骤（1）得到的肉苁蓉提取液、步骤（2）得到的仙茅提取液、步骤（3）得到的芡实液、柠檬酸钠、葡萄糖、棉籽糖、白藜芦醇、谷氨酸二乙酸四钠、玉米低聚肽、二十二碳六烯酸、双蒸水一起混匀后，静置，过滤，再向滤液中加入青霉素和链霉素，混匀，采用双蒸水补足，即得到牦牛冷冻精液稀释液；所述的牦牛冷冻精液稀释液pH值在6.8-7.2；
配制每100毫升冷冻稀释液中采用的物质如下：肉苁蓉提取液0.1-0.2mL、步骤（2）得到的仙茅提取液0.1-0.2mL、步骤（3）得到的芡实液0.1-0.2mL、柠檬酸钠1.3-1.5g、葡萄糖1.8-2....

【专利技术属性】
技术研发人员：陈树合，
申请(专利权)人：香格里拉藏龙生物开发股份有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53