鉴定乳腺癌状态的方法和试剂盒技术

一种在受试者中鉴定乳腺癌状态的方法，包括：1)从所述受试者采集生物样品；2)检测所述生物样品中生物标志物基因的甲基化水平，其中所述生物标志物基因选自如下基因的一种或多种：APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17；以及3)将步骤2)检测的甲基化水平与群体中相应生物标志物基因的正常甲基化水平进行比较，以确定所述受试者中的乳腺癌状态。还提供了用于鉴定受试者中乳腺癌状态的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】鉴定乳腺癌状态的方法和试剂盒
本专利技术涉及在受试者中鉴定乳腺癌状态的方法和试剂盒。
技术介绍
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，女性一生中患乳腺癌的概率约为10％，全世界每年约有乳腺癌病人130万人，约有40万人死于该病，并且以每年2％～3％的速度递增。在美国，乳腺癌的发病率占据女性恶性肿瘤第一位，其死亡率居恶性肿瘤死亡率的第二位。在我国，乳腺癌发病率也已跃居女性恶性肿瘤的首位，并且发病年龄呈年轻化趋势。乳腺癌已然成为全球范围内危害女性身体健康的头号杀手。乳腺癌病人的生存期和病理分期密切相关，病理分期越早治愈率越高，早期诊断对乳腺癌患者尤为重要。多项研究表明，大规模乳腺癌筛查可发现更多的早期病例，在患病率不断上升的背景下可逐步降低死亡率。目前对乳腺癌筛查主要依靠影像学手段，例如乳房X线摄影术、超声成像和磁共振成像等，然而，早期乳腺癌往往缺乏典型的症状和体征，这使得影像学技术在乳腺癌早期筛查中并不能显示出良好的效果。随着人们对乳腺癌发生的分子机制的逐步探究，乳腺癌早期诊断分子标志物的开发被高度关注，遗憾的是迄今为止没有发现一个敏感性和特异性较高的分子标志物。近年来乳腺癌表观遗传学研究进展较快，特别是DNA甲基化，研究发现在乳腺癌发生的早期就存在很多特有的肿瘤相关基因出现不同程度的甲基化状态改变，为乳腺癌早期诊断标志物的探索提供了新的契机。基因组的DNA甲基化异常与肿瘤的发生一直是医学界研究的热点之一，细胞周期、DNA修复、血管生成和细胞凋亡等都涉及到相关基因的甲基化。DNA高甲基化最可能的调控作用是通过抑制关键基因的表达，从而决定该细胞的命运，如对于肿瘤细胞中DNA甲基化异常现象的研究已经在多种肿瘤中取得了许多重大的进展。哺乳动物中，甲基化仅影响DNA链上鸟嘌呤前的胞嘧啶(CpG)，正常细胞中CpG双核苷酸的甲基化分布并不均一，大约50％的基因在启动子区域有CpG集中分布的CpG岛存在，长度0.5～2kb不等，该区域与基因的转录调控有着密切关系。人体某些基因调控区域的CpG岛甲基化在相关癌细胞组织中频繁出现，显示出与某些肿瘤的发病、病程进展和预后、用药敏感性等相关。迄今为止，已在大多数人类肿瘤中发现了基因甲基化异常，研究发现在癌细胞中表观遗传编码发生紊乱，首先表现在DNA甲基化水平紊乱，又称为甲基化重排。由于抑癌基因CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此，DNA甲基化的检测可以用于肿瘤发生的早期诊断。癌症相关基因甲基化也是乳腺癌发生的早期事件，因此相关基因甲基化状态可成为早期乳腺癌风险预测的有效指标。尽管如此，目前仍缺乏对这些癌症相关基因的甲基化状态进行有效检测并对检测结果进行处理的手段。
技术实现思路
为了解决上述问题，在一方面，本文提供了一种在受试者中鉴定乳腺癌状态的方法，其包括以下步骤：1)从所述受试者采集生物样品；2)检测所述生物样品中生物标志物基因的甲基化水平，其中所述生物标志物基因选自如下基因的一种或多种：APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17；以及3)将步骤2)检测的甲基化水平与群体中相应生物标志物基因的正常甲基化水平进行比较，以确定所述受试者中的乳腺癌状态。在一些实施方案中，所述方法还包括在所述受试者接受医疗处理后再次进行步骤1)和2)，并且将两次获得的甲基化水平检测结果进行比较，以确定所述受试者中乳腺癌状态的变化。在一些实施方案中，步骤2)中可包括从所述生物样品提取DNA并以亚硫酸氢盐处理，使得所述DNA中的未甲基化胞嘧啶残基脱氨基，而甲基化的胞嘧啶残基保持不变。在一些优选的实施方案中，所述亚硫酸氢盐为亚硫酸氢钠。在一些优选的实施方案中，步骤2)中所述生物标志物基因选自APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17中的2种或2种以上。在更优选的实施方案中，步骤2)中所述生物标志物基因选自APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17中的5种或5种以上。在一些具体实施方案中，步骤2)中所述生物标志物基因为BRCA1、CCND2、PITX2、RARB、以及RASSF1A。在一些优选的实施方案中，所述乳腺癌状态为乳腺癌I期或II期，所述生物标志物基因为APC和/或RASSF1A。在一些优选的实施方案中，所述乳腺癌状态为非浸润性癌，所述生物标志物基因为RARB和/或RASSF1A。在一些优选的实施方案中，所述乳腺癌状态为浸润性导管癌，所述生物标志物基因为APC、CCND2和/或RASSF1A。在一些优选的实施方案中，所述乳腺癌状态为浸润性小叶癌，所述生物标志物基因为CCND2和/或RASSF1A。在一些优选的实施方案中，所述乳腺癌状态为其它浸润性癌，所述生物标志物基因为CCND2和/或RARB。在一些实施方案中，步骤2)包括检测所述生物标志物基因内靶区域的甲基化水平，所述靶区域分别为所述生物标志物基因内至少15个碱基长度的核苷酸序列或其互补序列。在一些实施方案中，步骤2)中对APC基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：12和13所示序列的引物对或具有SEQ ID NO：16和17所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的APC基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对BRCA1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：20和21所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：24和25所示序列的引物对、或具有SEQ ID NO：28和29所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的BRCA1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对CCND2基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：32和33所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：36和37所示序列的引物对、或具有SEQ ID NO：40和41所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的CCND2基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对CST6基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：44和45所示序列的引物对或具有SEQ ID NO：48和49所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的CST6基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对GP5基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：52和53所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：56和57所示序列的引物对、或具有SEQ ID NO：60和61所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的GP5基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对GSTP1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：64和65所示序列的引物对或具有SEQ ID NO：68和69所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的GSTP1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对PITX2基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在受试者中鉴定乳腺癌状态的方法，包括以下步骤：/n1)从所述受试者采集生物样品；/n2)检测所述生物样品中生物标志物基因的甲基化水平，其中所述生物标志物基因选自如下基因的一种或多种：APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17；以及/n3)将步骤2)检测的甲基化水平与群体中相应生物标志物基因的正常甲基化水平进行比较，以确定所述受试者中的乳腺癌状态。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】一种在受试者中鉴定乳腺癌状态的方法，包括以下步骤：
1)从所述受试者采集生物样品；
2)检测所述生物样品中生物标志物基因的甲基化水平，其中所述生物标志物基因选自如下基因的一种或多种：APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17；以及
3)将步骤2)检测的甲基化水平与群体中相应生物标志物基因的正常甲基化水平进行比较，以确定所述受试者中的乳腺癌状态。


如权利要求1所述的方法，其中还包括在所述受试者接受医疗处理后再次进行步骤1)和2)，并且将两次获得的甲基化水平检测结果进行比较，以确定所述受试者中乳腺癌状态的变化。


如权利要求1或2所述的方法，其中所述乳腺癌状态包括乳腺癌易感性以及乳腺癌的存在、进展、亚型和/或分期。


如权利要求1或2所述的方法，其中步骤2)中包括从所述生物样品提取DNA并以亚硫酸氢盐处理，使得所述DNA中的未甲基化胞嘧啶残基脱氨基，而甲基化的胞嘧啶残基保持不变。


如权利要求4所述的方法，其中所述亚硫酸氢盐为亚硫酸氢钠。


如权利要求1或2所述的方法，其中步骤2)中所述生物标志物基因选自APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17中的2种或2种以上。


如权利要求6所述的方法，其中步骤2)中所述生物标志物基因选自APC、BRCA1、CCND2、CST6、GP5、GSTP1、PITX2、RARB、RASSF1A和SOX17中的5种或5种以上。


如权利要求7所述的方法，其中步骤2)中所述生物标志物基因为BRCA1、CCND2、PITX2、RARB、以及RASSF1A。


如权利要求1或2所述的方法，其中所述乳腺癌状态为乳腺癌I期或II期，所述生物标志物基因为APC和/或RASSF1A。


如权利要求1或2所述的方法，其中所述乳腺癌状态为非浸润性癌，所述生物标志物基因为RARB和/或RASSF1A。


如权利要求1或2所述的方法，其中所述乳腺癌状态为浸润性导管癌，所述生物标志物基因为APC、CCND2和/或RASSF1A。


如权利要求1或2所述的方法，其中所述乳腺癌状态为浸润性小叶癌，所述生物标志物基因为CCND2和/或RASSF1A。


如权利要求1或2所述的方法，其中所述乳腺癌状态为除浸润性导管癌和浸润性小叶癌之外的其它浸润性癌，所述生物标志物基因为CCND2和/或RARB。


如权利要求1或2所述的方法，其中步骤2)包括检测所述生物标志物基因内靶区域的甲基化水平，所述靶区域分别为所述生物标志物基因内至少15个碱基长度的核苷酸序列或其互补序列。


如权利要求1或2所述的方法，其中步骤2)中
对APC基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：12和13所示序列的引物对或具有SEQ ID NO：16和17所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的APC基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对BRCA1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：20和21所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：24和25所示序列的引物对、或具有SEQ ID NO：28和29所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的BRCA1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对CCND2基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：32和33所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：36和37所示序列的引物对、或具有SEQ ID NO：40和41所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的CCND2基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对CST6基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：44和45所示序列的引物对或具有SEQ ID NO：48和49所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的CST6基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对GP5基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：52和53所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：56和57所示序列的引物对、或具有SEQ ID NO：60和61所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的GP5基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对GSTP1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：64和65所示序列的引物对或具有SEQ ID NO：68和69所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的GSTP1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对PITX2基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：72和73所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：76和77所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：80和81所示序列的引物对、或具有SEQ ID NO：84和85所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的PITX2基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对RARB基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：88和89所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：92和93所示序列的引物对、或具有SEQ ID NO：96和97所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的RARB基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对RASSF1A基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：100和101所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：104和105所示序列的引物对、或具有SEQ ID NO：108和109所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的RASSF1A基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；以及
对SOX17基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：112和113所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：116和117所示序列的引物对、或如SEQ ID NO：120和121所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的SOX17基因或其片段为模板进行PCR扩增反应。


如权利要求15所述的方法，其中步骤2)中
对APC基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：12和13所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：14所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：16和17所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：18所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的APC基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对BRCA1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：20和21所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：22所示序列的封闭引物，使用具有SEQ ID NO：24和25所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：26所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：28和29所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：30所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的BRCA1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对CCND2基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：32和33所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：34所示序列的封闭引物，使用具有SEQ ID NO：36和37所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：38所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：40和41所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：42所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的CCND2基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对CST6基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：44和45所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：46所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：48和49所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：50所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的CST6基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对GP5基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：52和53所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：54所示序列的封闭引物，使用具有SEQ ID NO：56和57所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：58所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：60和61所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：62所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的GP5基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对GSTP1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：64和65所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：66所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：68和69所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：70所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的GSTP1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对PITX2基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：72和73所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：74所示序列的封闭引物，使用具有SEQ ID NO：76和77所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：78所示序列的封闭引物，使用具有SEQ ID NO：80和81所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：82所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：84和85所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：86所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的PITX2基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对RARB基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：88和89所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：90所示序列的封闭引物，具有SEQ ID NO：92和93所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：94所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：96和97所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：98所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的RARB基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对RASSF1A基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：100和101所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：102所示序列的封闭引物，使用具有SEQ ID NO：104和105所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：106所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：108和109所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：110所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的RASSF1A基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；以及
对SOX17基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：112和113所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：114所示序列的封闭引物，使用具有SEQ ID NO：116和117所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：118所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：120和121所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：122所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的SOX17基因或其片段为模板进行PCR扩增反应，
其中所述封闭引物具有抗DNA聚合酶延伸扩增的3’末端修饰。


如权利要求16所述的方法，其中步骤2)中
对APC基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：12和13所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：14所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：15所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：16和17所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：18所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：19所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的APC基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对BRCA1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：20和21所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：22所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：23所示序列的探针，使用具有SEQ ID NO：24和25所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：26所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：27所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：28和29所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：30所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：31所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的BRCA1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对CCND2基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：32和33所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：34所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：35所示序列的探针，使用具有SEQ ID NO：36和37所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：38所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：39所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：40和41所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：42所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：43所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的CCND2基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对CST6基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：44和45所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：46所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：47所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：48和49所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：50所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：51所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的CST6基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对GP5基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：52和53所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：54所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：55所示序列的探针，使用具有SEQ ID NO：56和57所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：58所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：59所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：60和61所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：62所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：63所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的GP5基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对GSTP1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：64和65所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：66所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：67所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：68和69所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：70所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：71所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的GSTP1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；
对PITX2基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：72和73所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：74所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：75所示序列的探针，使用具有SEQ ID NO：76和77所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：78所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：79所示序列的探针，使用具有SEQ ID NO：80和81所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：82所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：83所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：84和85所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：86所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：87所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的PITX...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明明，徐春叶，李淑钰，陈彦利，蒲珏，
申请(专利权)人：北京艾克伦医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11