一种银杏GbEAG转录因子及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种银杏GbEAG转录因子及其编码基因与应用。本发明专利技术所提供的GbEAG蛋白是如下（a1）或（a2）的蛋白质：（a1）由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列编码的蛋白；（a2）将SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与银杏内酯生物合成相关的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质；同时本发明专利技术还涉及编码该银杏GbEAG蛋白的基因序列。本发明专利技术通过VIGS沉默和酵母单杂交实验证明了GbEAG能够调控银杏内酯生物合成途径的关键基因表达。本发明专利技术是首次克隆到调控银杏内酯生物合成的AP2/ERF类转录因子并对其进行了功能验证，为筛选银杏内酯合成途径相关功能基因提供了重要研究手段，同时对调控银杏内酯的生物合成具有重要意义。合成具有重要意义。合成具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种银杏GbEAG转录因子及其编码基因与应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种银杏GbEAG转录因子及其编码基因与应用。

技术介绍

[0002]银杏Ginkgo biloba L.，为银杏科、银杏属落叶乔木，又名白果树、公孙树，是仅存于我国的珍稀树种之一，有“活化石”之称。
[0003]银杏内酯是银杏中特有的一类活性成分，属于萜类化合物，由倍半萜内酯和二萜内酯组成，二萜内酯主要包括银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C等，倍半萜内酯主要是白果内酯；银杏内酯作为血小板激活因子拮抗剂，能高度选择性地拮抗血小板聚集，防止血栓形成，被广泛应用于心脑血管疾病的治疗。萜类化合物生物合成途径主要分为MEP途径和MVA途径，目前对于银杏中银杏内酯生物合成的研究主要集中在合成途径关键酶上，且停留在比较靠前的共同通路上，对于调控银杏内酯生物合成相关的转录因子研究较少，所以探寻银杏中调控银杏内酯合成相关转录因子，对进一步研究银杏内酯生物合成的转录调控具有重要意义。
[0004]AP2/ERF类转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，已报道AP2/ERF类转录因子可调控多种药用植物生物活性成分的合成，在萜类化合物的生物合成中，长春碱、丹参酮、青蒿素和紫杉醇等重要活性成分都报道有AP2/ERF类转录因子的调控。本专利技术筛选并克隆得到一个AP2/ERF类转录因子GbEAG，通过VIGS瞬时沉默和酵母单杂交验证其对银杏内酯生物合成的调控作用，为使用代谢工程手段调控银杏中银杏内酯的生物合成打下了坚实的基础。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种银杏GbEAG蛋白及其编码基因，该基因编码一个乙烯响应的AP2/ERF类转录因子，其蛋白可以直接结合到银杏内酯合成途径基因GbIDI的启动子上，进而调控银杏内酯的生物合成。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]本专利技术涉及一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)的蛋白质：
[0008](a1)由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列编码的蛋白。
[0009](a2)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列同源性≧95％且与调控银杏内酯生物合成相关的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。
[0010]上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0011]所述蛋白的编码基因也属于本专利技术的保护范围。
[0012]所述基因为如下(b1)或(b2)：
[0013](b1)如序列表SEQ ID NO.1中第1～1182位所示的核苷酸序列；
[0014](b2)与序列表SEQ ID NO.1中第1～1182位所示的核苷酸序列同源性≧95％的核
苷酸序列。
[0015]含前文所述编码基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本专利技术的保护范围。
[0016]本专利技术还保护前文所述蛋白作为转录因子的应用。
[0017]前文所述的蛋白，或，前文所述的编码基因，或，前文所述的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在结合具有GCC
‑
Box区的启动子中的应用也属于本专利技术的保护范围。
[0018]前文所述的蛋白，或，前文所述的编码基因，或，前文所述的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在调控银杏内酯生物合成中的应用也属于本专利技术的保护范围。
[0019]本专利技术还保护前文所述的蛋白，或，前文所述的基因，或，前文所述的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在植物育种中的应用，其中，所述植物为银杏。
[0020]本专利技术利用银杏基因组与基因表达模式共分析的筛选方法从银杏中克隆并得到了一个AP2/ERF转录因子，命名为GbEAG(Ginkgo biloba，ERF transcription factor associated with ginkgolides biosynthesis)。通过荧光定量分析表明此基因在银杏须根中高表达，这与银杏内酯生物合成途径相关基因的表达模式一致(“Combining Metabolic Profiling and Gene Expression Analysis to Reveal the Biosynthesis Site and Transport of Ginkgolides in Ginkgo biloba L.”)。GbEAG属于ERF
‑
B3亚家族，ORF长度为1179bp，编码393个氨基酸，聚类分析显示其可能结合于GCC
‑
Box顺式作用元件，从而调控萜类化合物的生物合成。通过VIGS沉默分析，结果表明GbEAG的敲低会导致银杏内酯合成途径关键基因表达下降，从而导致银杏内酯A含量降低。进一步的酵母单杂交分析表明GbEAG可以结合于GbIDI启动子的GCC
‑
Box上，调控银杏内酯的生物合成。本专利技术是首次从银杏中克隆并鉴定了AP2/ERF类转录因子，并对其功能进行了验证，为深入解析银杏内酯的生物合成途径与表达调控提供了技术依据与思路。
附图说明
[0021]图1为在银杏根中特异性高表达且受MeJA诱导的AP2/ERF类转录因子的表达量热图。
[0022]横坐标分别为叶、茎、根、MeJA诱导3小时的根、MeJA诱导6小时的根各取三个生物样本。
[0023]图2为筛选得到的银杏AP2/ERF类转录因子与已报道的调控萜类生物合成途径的AP2/ERF类转录因子共同构建的进化树。
[0024]图3左侧为GbEAG扩增ORF电泳检测图；右侧为VIGS扩增GbEAG靶片段电泳图。
[0025]图4为GbEAG与同源ERF转录因子氨基酸序列比对图(下划线表示ERF保守结构域)。
[0026]图5为GbEAG在银杏幼苗不同组织部位的表达情况，MR为Mature Root，FR为Fibrous Root，OS为Old stem，YS为Young Stem，L为Leaf。
[0027]图6为GbEAG以及银杏内酯合成途径相关基因在VIGS沉默后的基因表达情况(*代表P<0.05，**代表P<0.01)。
[0028]图7为VIGS沉默GbEAG后须根中银杏内酯的含量；GA为银杏内酯A、GB为银杏内酯B、GC为银杏内酯C、BB为白果内酯。
[0029]图8为GbEAG激活GbIDI启动子的酵母单杂交实验结果图，其中上为阳性对照，中为GbEAG与含GCC
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Box的启动子互作结果，下为阴性对照，700ng/mL为AbA最低抑制浓度。
具体实施方式
[0030]下面结合具体实施例，对本专利技术进行进一步阐明，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下面实施例中未注明具体条件的试验方法，均按常规方法进行。
[0031]实施例1、调控银杏萜类物质生物合成途径AP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种银杏GbEAG蛋白，是如下（a1）或（a2）的蛋白质：（a1)由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列编码的蛋白；（a2)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列同源性≧95%且与调控银杏内酯生物合成相关的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。2.权利要求1所述GbEAG蛋白的编码基因。3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述基因为如下（b1）或（b2）：（b1）如序列表SEQ ID NO.1中第1～1182位所示的核苷酸序列；（b2）与序列表SEQ ID NO.1中第1～1182位所示的核苷酸序列同源性≧95%的核苷酸序列。4.含权利要求2或...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆续，李萍，杜金法，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：