一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株及其构建方法和发酵方法技术

本发明专利技术涉及酿酵母菌株构建及发酵技术领域，特别涉及一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株及其构建方法和发酵方法。该酵母基因工程菌株的改造包括：转入CrIS、NmIS2、OeIS、OYE2、OYE3基因中的一种或几种；将酵母底盘菌株的ERG20突变为ERG20

【技术实现步骤摘要】
一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株及其构建方法和发酵方法


[0001]本专利技术涉及酿酵母菌株构建及发酵
，特别涉及一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株及其构建方法和发酵方法。

技术介绍

[0002]香茅醇(Citronellol，3,7
‑
二甲基
‑6‑
辛烯
‑1‑
醇，C
10
H
20
O，分子量为156.27)，是一种手性线性单萜化合物，分为左旋香茅醇(玫瑰醇)、右旋香茅醇和消旋香茅醇三种。香茅醇存在于多种植物挥发油中，比如香茅油、玫瑰油、芸香油等。由于气味香甜优雅，在香精香料领域占有广阔的市场，每年的需求量在1000吨以上，可被用于化妆品、护肤品、洗浴用品以及家庭清洁用品等。香茅醇还可被用于农业领域，具有较好的杀虫效果。除此之外，香茅醇还被证明具有十多种药理活性，而且毒性较低，可被用于比如抗炎、抗痉挛、抗痛觉过敏、降低胆固醇等。由于香茅醇具有手性中心，可以为合成其他手性化合物添加手性中心。
[0003]目前香茅醇的生产主要是通过从植物精油中提取或者化学全合成和半合成的方式，存在环境污染、能源浪费且安全性不好控制、成本较高等问题。研究日趋成熟的微生物细胞工厂为生产香茅醇提供了一个绿色高效、符合可持续发展要求的有潜力的平台。随着合成生物学的发展，基因编辑越来越便捷，微生物细胞工厂的构建和改造成本也越来越低。酿酒酵母是第一个被测序的真核模式生物，具有清楚的遗传学背景而且基因改造较为简单，最重要的是酿酒酵母是通过美国食品药品监督管理局认证的安全菌株。
[0004]目前香茅醇的天然生物合成路径并不清楚，由微生物从头全合成香茅醇的研究也很少。最早在1999年的时候发现，香叶天竺葵(Pelargonium graveolens)能够将香茅基焦磷酸(CPP)转化为玫瑰醚，玫瑰醚结构与香茅醇高度类似，因此他们推断以CPP为底物能够生成香茅醇，但是现在并没有在植物中发现CPP以及与CPP相关的酶。2019年首都医科大学的张夏楠团队通过分析雷公藤植物的基因组，首次发现了一个可以体外催化GPP(牦牛儿基焦磷酸)生成香茅醇的基因，但是催化效率很低。生物转化相关的文献早有提及酿酒酵母能够将柠檬醛和香叶醇转化为香茅醇，但是具体负责催化的酶并不清楚而且副反应多，催化效率很低。从2010以后，香茅醇生物合成受到了越来越多研究者的注意，他们发现香茅醇可以通过香叶醇中C2＝C3碳碳双键的还原获得，这一步还原反应可以利用酿酒酵母内源的老黄酶或者植物来源的还原酶实现。2011年和2013年，国内外两个团队分别证实了酿酒酵母内源的老黄酶OYE2能够将香叶醇还原得到香茅醇，但也仅限于酶功能的验证。2012年，Cooner教授的团队首次发现，来自长春花Catharanthus roseus的环烯醚萜合酶CrIS能够还原香叶醇衍生物中的C2＝C3。2016年，Campbell通过体内和体外实验证明，CrIS确实能够香叶醇还原为香茅醇，香茅醇产量达到200mg/L。所以，以香叶醇为底物在还原酶的催化下获得香茅醇是一种很有潜力的方法。如何进一步提高香茅醇产量需要继续研究。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株及其构建方法和发酵方法。该酵母基因工程菌株经发酵培养后的香茅醇产量得到了显著提高。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株，该酵母基因工程菌株的改造包括如下一种或几种：
[0008]1)转入CrIS、NmIS2、OeIS、OYE2、OYE3基因中的一种或几种；
[0009]2)将酵母底盘菌株的ERG20突变为ERG20
F96W
；
[0010]3)在表达异构酶IDI1、还原酶CrIS和融合蛋白GE的同时，引入由SH3、PDZ、GBD组成的蛋白支架，组装成蛋白复合体。
[0011]在本专利技术中，酵母底盘菌株为酿酒酵母、解脂属酵母、克鲁维属酵母、藻类、霉菌、细菌中的一种。
[0012]优选地，酵母底盘菌株为酿酒酵母。
[0013]在本专利技术中，霉菌包括但不限于链霉菌，细菌包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。
[0014]优选地，酿酒酵母底盘菌株为CEN.PK系列或BY系列。
[0015]在本专利技术提供的具体实施例中，酿酒酵母底盘菌株为CEN.PK2
‑
1C。
[0016]作为优选，酵母底盘菌株为强化甲羟戊酸路径的酵母菌株。
[0017]本专利技术还提供了一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株的构建方法，构建方法包括如下一种或几种改造：
[0018]1)转入CrIS、NmIS2、OeIS、OYE2、OYE3基因中的一种或几种；
[0019]2)将酵母底盘菌株的ERG20突变为ERG20
F96W
；
[0020]3)在表达异构酶IDI1、还原酶CrIS和融合蛋白GE的同时，引入由SH3、PDZ、GBD组成的蛋白支架，组装成蛋白复合体。
[0021]作为优选，蛋白支架为SH3
‑
PDZ
‑
GBD、SH3
‑
PDZ2‑
GBD2、SH3
‑
PDZ3‑
GBD3、SH3
‑
PDZ4‑
GBD2、SH3
‑
PDZ2‑
GBD4。
[0022]作为优选，PDZ与GBD的数量之比为1:1。
[0023]优选地，蛋白支架为SH3
‑
PDZ
‑
GBD。
[0024]作为优选，步骤3)中，IDI1与SH3的配体连接，CrIS与PDZ的配体连接，GE与GBD的配体连接。
[0025]本专利技术还提供了一种生产香茅醇的发酵方法，包括如下步骤：
[0026]将上述酵母基因工程菌株进行发酵培养，得到香茅醇；
[0027]发酵培养包括发酵第一阶段和发酵第二阶段，发酵第一阶段以葡萄糖作为碳源，发酵第二阶段以乙醇作为碳源。
[0028]本专利技术提供了一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株及其构建方法和发酵方法。该酵母基因工程菌株的改造包括如下一种或几种：1)转入CrIS、NmIS2、OeIS、OYE2、OYE3基因中的一种或几种；2)将酵母底盘菌株的ERG20突变为ERG20
F96W
；3)在表达异构酶IDI1、还原酶CrIS和融合蛋白GE的同时，引入由SH3、PDZ、GBD组成的蛋白支架，组装成蛋白复合体。本专利技术的优点如下：
[0029]本专利技术开发了一种利用重组酿酒酵母菌株高产香茅醇的方法，有效地将廉价的碳源转化为香茅醇。发酵过程采用两相发酵，减轻单萜细胞毒性并且提供萃取拉力，为香茅醇的生产提供了一种切实可行的方法。
[0030]本专利技术的重组酿酒酵母菌株相对于现有技术更为环保、成本低本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株，其特征在于，所述酵母基因工程菌株的改造包括如下一种或几种：1)转入CrIS、NmIS2、OeIS、OYE2、OYE3基因中的一种或几种；2)将酵母底盘菌株的ERG20突变为ERG20
F96W
；3)在表达异构酶IDI1、还原酶CrIS和融合蛋白GE的同时，引入由SH3、PDZ、GBD组成的蛋白支架，组装成蛋白复合体。2.根据权利要求1所述的酵母基因工程菌株，其特征在于，所述酵母底盘菌株为酿酒酵母、解脂属酵母、克鲁维属酵母、藻类、霉菌、细菌中的一种。3.根据权利要求1所述的酵母基因工程菌株，其特征在于，所述酿酒酵母底盘菌株为CEN.PK系列或BY系列。4.根据权利要求1所述的酵母基因工程菌株，其特征在于，所述酵母底盘菌株为强化甲羟戊酸路径的酵母菌株。5.一种高产香茅醇的酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下一种或几种改造：1)转入CrIS、NmIS2、OeIS、OYE2、OYE3基因中的一种或几种；2)将酵母底盘菌株的ERG20突变为ERG20
F96W
；3)在表达异构酶IDI1、还原酶CrIS和融合蛋白GE...

【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，姜国珍，肖文海，姚明东，王颖，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：