一种脲基酰胺水解酶展示菌株的构建和应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一种以cwp2作为锚定蛋白将脲基酰胺水解酶展示在酿酒酵母细胞表面的菌株构建方法及应用。通过将cwp2锚定蛋白与目标蛋白UA融合构建ACCD展示菌株，使得黄酒发酵液中的尿素降解率达到89.9％以上，EC降解率在56.4％以上。ACCD菌株培养72h时能达到12000U/g(干细胞)左右的酶活，和商品化脲酶相比，展示酶有更高的热稳定性和耐受性。ACCD作为酶制剂处理黄酒发酵液时的尿素降解率和EC降解率最高，重复利用十次仍能够保持80％以上的初始尿素降解率，且处理前后黄酒的风味物质未发生明显的变化。因此，ACCD展示酶菌株具有广阔的市场前景。场前景。场前景。

【技术实现步骤摘要】
一种脲基酰胺水解酶展示菌株的构建和应用


[0001]一种降低黄酒发酵液中尿素和氨基甲酸乙酯的脲基酰胺水解酶展示菌株的构建和应用。

技术介绍

[0002]氨基甲酸乙酯(简称EC)广泛存在于各类发酵食品和饮料中，目前已经被归为2A类的致癌物质，对人体有着潜在的危害。随着人们生活水平的提高，酒类饮品已成为生活中不可或缺的一部分。2016年6月15日，香港消费者委员会公布了36款酒精饮品的检测结果，36款酒精饮料中34款含有EC，且黄酒中EC含量较高，该调查结果不仅引起了黄酒行业和消费者的高度重视，也将黄酒的食品安全问题推到了风口浪尖。因此，有效的降低黄酒中的氨基甲酸乙酯保障食品安全和维护消费者的健康，保证黄酒市场的稳定性，促进黄酒在国际上的发展成为现在首当其冲需要解决的现实问题。
[0003]为控制EC的含量，首先要明确EC的来源。黄酒中的EC主要是由氨甲酰化合物和乙醇反应生成的，氨甲酰化合物主要包括尿素、L-瓜氨酸、氨甲酰磷酸等，而黄酒中的L-瓜氨酸和氨甲酰磷酸含量很少，因此，尿素成为黄酒中氨基甲酸乙酯生成的最主要的前体物质。
[0004]根据EC的形成机理，降低其浓度的方法主要有：物理方法、酶方法、酵母基因改造、筛选低产尿素的酿酒酵母等。其中物理方法主要为：原料处理、物理吸附。因尿素是清酒和黄酒中EC的主要前体，通过精制大米降低尿素的浓度，可以减少EC的形成。树脂、分子助剂或木炭特异性吸附处理黄酒和白酒中的EC。常用的酶法为：添加酸性脲酶或氨基甲酸乙酯酶。酸性脲酶可以降解尿素，进而减少EC的形成；氨基甲酸乙酯酶可以直接降解已形成的EC。酵母基因改造包括：抑制精氨酸酶基因(CAR1)胞内的表达；促进脲基酰胺水解酶基因(DUR1，2)胞内的表达；提高尿素从胞外向胞内转运的蛋白基因(DUR3)的表达水平；抑制尿素从胞内向胞外转运的蛋白基因(DUR4)的表达。为了解决原料中的营养物质流失、物理吸附和额外添加脲酶和氨基甲酸乙酯酶的高成本问题，故选择通过基因工程改造的方法构建低产尿素进而低产氨基甲酸乙酯的重组菌株。
[0005]酵母表面展示技术的研究最早始于1993年，此后发展十分迅速，在酵母细胞壁结构研究的基础上发展了多个基于不同锚定蛋白的展示系统。由于酿酒酵母遗传背景及其细胞壁结构较清晰，遗传操作简单，安全可靠，且又是酒类饮品的发酵主体微生物，因此酿酒酵母是酵母表面展示系统最常用的宿主细胞。用于酵母表面展示的载体蛋白均为细胞壁结合蛋白，外源蛋白通过和载体蛋白融合的方式固定在细胞壁表面。酿酒酵母载体蛋白根据其与细胞壁结合位点可分为C端锚定的载体蛋白和N端锚定的载体蛋白。C端锚定的载体蛋白主要为GPI蛋白，由两条烷基链结合到膜上，当GPI蛋白结合到其甘露糖链上时，甘露糖链会被一种磷脂酶从烷基链上解离下来，从而分泌到细胞壁外层，在细胞壁外层，GPI蛋白通过甘露糖链共价结合到β-1，6-葡聚糖链上。这类载体蛋白中最常用的为α凝集素，其它的如aga1蛋白、cwp2蛋白、flo1蛋白C端等也有报道。利用蛋白为载体蛋白进行表面展示时，目的蛋白被融合在GPI蛋白的N端，融合蛋白通过GPI蛋白C端的GPI锚定信号共价结合到细胞壁
上。N端锚定的载体蛋白主要有三种：flo1蛋白的N端、pir蛋白和a凝集素。flo1蛋白的N端为絮凝结构域，它识别细胞壁中的甘露聚糖组分并与之非共价结合，引起细胞聚集成可逆性絮状物。pir蛋白通过酯键共价结合在细胞壁上，但不稳定，易被弱碱从细胞壁解离下来。a凝集素由2个亚基组成，aga1结合到细胞壁，而aga2则通过二硫键结合到aga2上，将目的蛋白融合到aga2的C端即可进行表面展示，但是其展示量依赖于aga1的表达量。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种脲基酰胺水解酶(UA)的新应用，也就是在酿酒酵母细胞表面展示UA以降解黄酒中的尿素含量，进而降解黄酒中的氨基甲酸乙酯的含量的应用。展示成功的菌株既可以作为发酵主体微生物在黄酒发酵过程中降解前酵酒液中的尿素含量进而减少EC含量，还可以作为一种固定化酶制剂用于黄酒发酵结束后的加工处理，菌体细胞作为固定化酶的载体，可以反复多次回收利用且处理前后黄酒的风味物质变化不大，节约了工业黄酒生产的后加工处理成本，降解尿素和氨基甲酸乙酯的含量，提高了黄酒的品质。
[0007]具体的表面展示UA菌株的构建是选择cwp2作为锚定蛋白，在锚定蛋白与目标蛋白之间加入连接肽可以增加融合蛋白的柔性，使融合蛋白在细胞壁上展示时能处于势能最低的状态。另外，融合蛋白要想高强度的表达，还需要强启动子PGK1
p
和强终止子PGK1
t
的调控。融合蛋白整体在酿酒酵母本身信号肽的引导下，从内质网分泌出来，随后到达高尔基体，最后到达质膜，最终展示在酿酒酵母细胞表面。
[0008]本专利技术还将提供展示在酿酒酵母细胞表面的UA的酶学性质以及作为一种固定化酶制剂在降解尿素的能力和重复利用率中的优势。
[0009]一株降解尿素的酿酒酵母基因工程展示菌株，是以酿酒酵母为出发菌株，敲除酿酒酵母基因组中的精氨酸酶基因CAR1同时利用cwp2作为锚定蛋白在酿酒酵母细胞表面展示UA所得；
[0010]优选地，所述出发酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315；
[0011]优选地，所述精氨酸酶基因CAR1，其Gene ID为：855993，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO：1所示；
[0012]优选地，所述脲基酰胺水解酶基因DUR1，2，其Gene ID为852507，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO：2所示；
[0013]优选地，所述cwp2锚定蛋白基因CWP2，其Gene ID为853765，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO：3所示；
[0014]优选地，所述信号肽基因STE2，其Gene ID为850518，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO：4所示；
[0015]优选地，所述连接肽基因(G4S)3，其氨基酸序列为：GGGGSGGGGSGGGGS密码子优化后核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO：5所示；
[0016]所述启动子PGK1
p
其Gene ID为：850369，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示；
[0017]所述终止子PGK1
t
其Gene ID为：850372，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：7所示；
[0018](1)cwp2作为锚定蛋白展示UA重组菌株(ACCD)的构建
[0019]1)从NCBI上获得脲基酰胺水解酶基因DUR1，2，强启动子基因PGK1
P
，强终止子基因PGK1
t
；信号肽基因STE2；cwp2基因CWP2；NCBI将连接肽的氨基酸序列根据宿主细胞为酿酒酵母而优化密码子获得的核酸序列(G4S)3。
[0020]2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株低产尿素的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，是以酿酒酵母作为出发菌株，敲除精氨酸酶基因的同时，在相同的位点将锚定蛋白与脲基酰胺水解酶融合，使得脲基酰胺水解酶展示在酵母细胞表面所得。2.如权利要求1所述的一株低产尿素酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述精氨酸酶编码基因CAR1，其Gene ID为：855993，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO：1所示。3.如权利要求1所述的一株低产尿素酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述脲基酰胺水解酶编码基因DUR1，2，其Gene ID为：852507，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO：2所示。4.如权利要求1所述的一株低产尿素展示酶酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述cwp2锚定蛋白的编码基因CWP2，其Gene ID为：854577，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO：3所示。5.权利要求1所述的低产尿素的ACCD酵母表面展示菌株，其特征在于，构建方法如下：(1)重组质粒Yep3...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈叶福，邓庆博，王欢，江森，李蕊蕊，张果，石文琪，武晓乐，郭学武，肖冬光，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：