一种高通量检测和判定幽门螺旋杆菌耐药性的方法技术

本发明专利技术公开了一种高通量检测和判定幽门螺旋杆菌耐药性的方法，包括以下步骤：S1、石蜡标本和新鲜胃镜活检核酸提取；S2、核酸提取；S3、靶基因扩增与测序采用SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
一种高通量检测和判定幽门螺旋杆菌耐药性的方法


[0001]本专利技术涉及一种高通量检测和判定幽门螺旋杆菌耐药性的方法。

技术介绍

[0002]幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种革兰氏阴性碱性厌氧菌，主要分布在胃窦的粘膜组织中，幽门螺旋杆菌感染可导致慢性萎缩性胃炎、胃溃疡、胃癌和和胃淋巴瘤等消化道疾病，幽门螺旋杆菌的早期根除非常必要。目前多种抗生素(克拉霉素、阿莫西林、左氧氟沙星、呋喃唑酮、四环素、甲硝唑等)作为根除Hp三联治疗的手段被广泛应用。但是幽门螺旋杆菌对抗生素会产生耐药性，并且目前国际国内的抗生素耐药性普遍逐年升高，而根除率也随之大幅度下降，从最初的95％降至65％，预计在未来耐药性将成为Hp治疗的主要障碍。因此，专家意见及最新共识均认为，已有耐药迹象的患者在治疗前，应先做耐药性试验，以便指导合适药物的选择。
[0003]目前已有针对个别抗生素(例如克拉霉素)耐药基因的检测方法及PCR试剂盒，但是尚缺乏针对所有主流抗生素的耐药位点进行全面检测的检测手段和试剂盒。同时，目前这些检测方法都需要进行Hp体外培养，由于体外培养周期长，易污染且阳性率较低，延误了临床治疗。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术中幽门螺旋杆菌耐药性检测需要经过体外培养进行扩增，体外培养需要无氧培养系统，限制了幽门螺旋杆菌耐药性的检测的缺陷，提供一种高通量检测和判定幽门螺旋杆菌耐药性的方法。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：
[0006]本专利技术利用多引物扩增技术从石蜡样本或者新鲜组织中直接扩增幽门螺旋杆菌与耐药相关的靶基因，无须进行体外扩增，同时利用高通量测序技术快速完成幽门螺旋杆菌耐药突变检测，检测准确率与PCR和一代测序技术相当。
[0007]一种高通量检测和判定幽门螺旋杆菌耐药性的方法，包括以下步骤：
[0008]S1、石蜡标本和新鲜胃镜活检核酸提取
[0009]S11确认病人受检前停止服用抗生素一个月以上，质子泵抑制剂二周以上，中药二周以上，且经尿素呼气试验验证为阳性；
[0010]S12、确认采样的胃黏膜组织标本新鲜无污染，无食物残渣遗留；
[0011]S13在胃镜活检取样时尽量取胃窦与胃体病变部位双份样本，各两块，共四块标本分别放入一个运送培养基试管内，并确认组织样本浸入运送培养基的液体中，拧紧试管盖，48小时内2
‑
8度冷藏运输；另外两块送病理科制作石蜡切块样本；
[0012]初治患者的幽门螺旋杆菌多分布千胃窦距幽门2
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5cm处，补救治疗患者的幽门螺旋杆菌会从胃窦转移到胃体和胃底，因此对后者要同时采集胃底和胃体处样本。多次根除治疗失败的患者，建议距上次治疗结束至少3个月，甚至更长(共识建议2个月)。
[0013]S2、核酸提取
[0014]对石蜡样本或新鲜活检样本采用试剂盒进行核算提取；针对石蜡样本，使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit进行核酸提取。针对新鲜活检样本，使用QIAamp Fast DNA Tissue Kit进行核酸提取。
[0015]S3、靶基因扩增与测序
[0016]采用Primer3算法针对靶基因序列进行引物设计，引物覆盖靶基因所有序列。使用HS DNA Polymerase进行靶基因扩增，为了避免引物之间的相互干扰，共使用了2组引物进行扩增。
[0017][0018][0019][0020]使用Ion AmpliSeq
TM
Library Kit Plus构建测序文库，进行靶基因测序。
[0021]S4、耐药位点分析和判读
[0022]Ion Torrent测序数据质量控制和序列比对使用Ion iReporter，突变筛选标准为至少5条序列，正向反向至少有1条序列支持相应的突变，最终相关突变信息与耐药信息列表进行对照进行判读。
[0023]突变位点及对应抗生素药物参照表
[0024][0025][0026]4、如权利要求1所述的高通量检测和判定幽门螺旋杆菌耐药性的方法，其特征在于，S4中采用Ion Torrent测序数据质量控制，序列比对使用Ion iReporter。
[0027]有益效果：
[0028]本专利技术从石蜡样本或者新鲜的胃镜活检样本出发，不需要培养可以直接进行耐药基因检测。本专利技术使用多重PCR技术从石蜡样本或新鲜组织中扩增幽门螺旋杆菌耐药基因，通过高通量测序技术全面反应幽门螺旋杆菌所有可能耐药突变，缩短了检测周期，进一步提高了幽门螺旋杆菌耐药检出率。能够全面地鉴定出针对克拉霉素、阿莫西林、左氧氟沙
星、呋喃唑酮、四环素、甲硝唑和利福喷丁等目前常用的7种幽门螺旋杆菌感染治疗药物的耐药基因的具体位点情况，解读出该型菌株的耐药性，从而指导幽门螺旋杆菌感染患者的个性化治疗。且本方法可扩展性强，即随着幽门螺杆菌耐药基因组学研究的进一步深入，未来若发现新的耐药基因或耐药位点，一旦生物学功能明确，可以随时扩充到本专利技术的基因及位点列表中。
具体实施方式
[0029]以下对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0030]实施例
[0031]实验材料与试剂
[0032]石蜡样本核酸提取试剂盒：QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Catalog ID:56404,Qiagen)
[0033]组织样本核酸提取试剂盒：QIAamp Fast DNA Tissue Kit(Catalog ID:51404,Qiagen)
[0034]核酸扩增试剂盒：TaKaRa Taq，HS DNA Polymerase(购自宝生物工程(大连)有限公司)
[0035]测序文库构建试剂盒：Ion AmpliSeq
TM
Library Kit Plus(货号：4488990)
[0036]核酸纯化试剂盒：AMPure XP Beads(货号：A63880)
[0037]实验仪器
[0038]PCR扩增仪：ABI 9700PCR扩增仪
[0039]Ion Torrent测序仪：Ion Personal Genome Machine(PGM)测序仪
[0040]实施例1：石蜡标本和新鲜胃镜活检核酸提取
[0041]1)确认病人受检前停止服用抗生素一个月以上，质子泵抑制剂二周以上，中药二周以上，且经尿素呼气试验(UBT)验证为阳性。
[0042]2)确认采样的胃黏膜组织标本新鲜无污染，无食物残渣遗留。
[0043]3)在胃镜活检取样时尽量取胃窦与胃体病变部位双份样本，各两块，共四块标本分别放入一个运送培养基试管内，并确认组织样本浸入运送培养基的液体中，拧紧试管盖，48小时内2
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8度冷藏运输；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高通量检测和判定幽门螺旋杆菌耐药性的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、石蜡标本和新鲜胃镜活检核酸提取S11确认病人受检前停止服用抗生素一个月以上，质子泵抑制剂二周以上，中药二周以上，且经尿素呼气试验验证为阳性；S12、确认采样的胃黏膜组织标本新鲜无污染，无食物残渣遗留；S13在胃镜活检取样时尽量取胃窦与胃体病变部位双份样本，各两块，共四块标本分别放入一个运送培养基试管内，并确认组织样本浸入运送培养基的液体中，拧紧试管盖，48小时内2
‑
8度冷藏运输；另外两块送病理科制作石蜡切块样本；S2、核酸提取对石蜡样本或新鲜活检样本采用试剂盒进行核算提取；S3、靶基因扩增与测序采用SEQ ID NO.1
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SEQ ID NO.22的正向引物和SEQ ID NO.23
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SEQ ID NO.44的引物对进行靶基因扩增；S4、耐药位点分析和判读突...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄新祥，
申请(专利权)人：江苏意诺飞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：