一种同时检测艾伯特埃希氏菌O8和O9血清型的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及细菌检测领域，具体涉及一种同时检测艾伯特埃希氏菌O8和O9血清型的试剂盒。本发明专利技术发现了艾伯特埃希菌的O8和O9两个新血清型，并优化并得到了同时检测艾伯特埃希氏菌O8和O9血清型的靶序列、特异性引物对和检测方法，该检测体系不仅能在一个PCR反应中同时检测2种血清型，还可以确定所检测菌株是否为艾伯特埃希菌；同时具有优良的灵敏性和特异性。该引物的发现及方法的建立提升了艾伯特埃希菌的血清分型能力，对于艾伯特埃希菌的监测和后续的流行病学研究具有重要意义。后续的流行病学研究具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测艾伯特埃希氏菌O8和O9血清型的试剂盒


[0001]本专利技术涉及细菌检测领域，具体涉及一种同时检测艾伯特埃希氏菌O8和O9血清型的试剂盒。

技术介绍

[0002]艾伯特埃希菌(Escherichia albertii，E.albertii)是近年发现和命名的一个新的与人散发肠道感染及突发食源性腹泻事件有关的肠道致病菌。1991年，Albert等从孟加拉达卡腹泻伴有呕吐、发热、轻度脱水和腹胀的儿童粪便标本中首次分离到艾伯特埃希菌。2003年，Huys等通过表型及基因型分析将其确定为埃希菌属中的一个新种，并命名为E.albertii(艾伯特埃希菌)。2011年11月，日本秋田县出现一起艾伯特埃希菌相关的胃肠炎病例暴发事件。此外，美国明尼苏达州和伊利诺斯州的腹泻患者、几内亚比绍健康人中也分离到该菌。1993-2009年间Ooka等从日本、比利时、巴西、德国的胃肠道感染患者中分离到13株艾伯特埃希菌，从无症状携带者中分离到1株艾伯特埃希菌。据推测，艾伯特埃希菌可能是美国每年由不明原因引起的62,000,000余例及3,200例死亡的食源性疾病的原因之一。此外，国外学者也陆续从家禽家畜，野生动物，鸟类等动物宿主也分离出艾伯特埃希菌。专利技术人首次在中国腹泻患者、健康人群、野生白鹭、家禽和动物源性食品中证实了艾伯特埃希菌的存在，提示艾伯特埃希菌在我国存在着较大的人间感染的风险。
[0003]脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性(G-)细菌外膜的重要组成部分，对细菌在环境及宿主中的生存起重要的作用。O-抗原多糖不仅是LPS的重要组成部分，也是G-细菌血清多样性的决定成分。在同一种的细菌中O-抗原的组成及结构都有明显的差异。基于识别LPS中不同种类的O抗原的血清分型技术将在艾伯特埃希菌的监测工作及流行病学研究中提供非常有价值的信息。O-抗原合成相关基因位于细菌的染色体上，称为O-抗原生物合成相关基因簇(O-antigen biosynthesis gene cluster，O-AGC)。专利技术人之前的研究证实艾伯特埃希菌的O抗原是通过Wzx/Wzy途径合成。此外，还发现并命名了艾伯特埃希菌的7种血清型EAO1-EAO7。其中，每种血清型都有型特异的wzy基因，且wzy基因具有高度的型内保守性和型间变异性，可做为分子血清分型的靶基因。

技术实现思路

[0004]在长期研究中，本专利技术分别从鸭肠内容物及腹泻儿童粪便中分离到两株艾伯特埃希菌，与已知的7种血清型的诊断血清均不凝集，基因组测序和生物信息学分析后发现其携带新的O-AGCs，其wzy基因序列与之前报道的7种血清型的wzy基因序列有明显差别，提示其为新的血清型别，本专利技术将其命名为EAO8与EAO9血清型，并将定位到的wzy基因作为检测的靶基因，优化得到了同时检测艾伯特埃希氏菌O8和O9血清型的特异性引物对，同时据此建立了多重PCR的检测方法。
[0005]具体而言，本专利技术首先提供用于同时检测艾伯特埃希氏菌O8和O9血清型的靶序列，包括：
[0006]用于检测艾伯特埃希氏菌O8血清型的靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
[0007]用于检测艾伯特埃希氏菌O9血清型的靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0008]经过优化设计，本专利技术进一步提供同时检测艾伯特埃希氏菌O8和O9血清型的特异性引物对，包括：
[0009]用于检测艾伯特埃希氏菌O8血清型的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；
[0010]用于检测艾伯特埃希氏菌O9血清型的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示。
[0011]本专利技术进一步提供所述的特异性引物对在制备同时检测艾伯特埃希氏菌O8和O9血清型的试剂或试剂盒中的应用。
[0012]本专利技术进一步提供一种内参引物与所述的特异性引物对配合使用在制备同时检测艾伯特埃希氏菌O8和O9血清型的试剂或试剂盒中的应用，所述内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示。
[0013]进一步的，本专利技术还提供一种同时检测艾伯特埃希氏菌O8和O9血清型的试剂盒，含有所述的特异性引物对。
[0014]作为优选，所述试剂盒还含有内参引物，所述内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示。
[0015]作为优选，各引物在工作时的浓度为0.5μM。
[0016]作为优选，若PCR产物片段中包括大小为407bp的片段，则待测样品中存在艾伯特埃希氏菌O8血清型；
[0017]若PCR产物片段中包括大小为925bp的片段，则待测样品中存在艾伯特埃希氏菌O9血清型。
[0018]作为优选，所述试剂盒在工作时的反应程序如下：94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，30个循环，最后在72℃延伸10分钟。
[0019]进一步的，本专利技术还提供所述的特异性引物对或所述的试剂盒在检测艾伯特埃希氏菌O8和/或O9血清型中的应用。
[0020]比如，在一些实施方案中，可以通过检测人或动物的离体样本，来判断其是否感染艾伯特埃希氏菌O8和/或O9血清型。在一些实施方案中，还可以检测食品(尤其是动物源性食品)或其他可能感染艾伯特埃希菌的样品中是否含有艾伯特埃希氏菌O8和/或O9血清型，以利于艾伯特埃希菌的监测工作及流行病学研究。
[0021]进一步的，本专利技术还提供一种检测艾伯特埃希氏菌O8和O9血清型的方法，以待测样品的DNA为模板，利用所述的特异性引物对或所述的试剂盒进行PCR扩增，根据扩增产物判断所述待测样品是否含有艾伯特埃希氏菌O8和/或O9血清型。
[0022]在以诊断为目的时，所述的待测样品可以为人或动物的粪便或血液等离体样本。除此之外，所述的待测样品还可以是食品(尤其是动物源性食品)或其他可能感染艾伯特埃希菌的样品。
[0023]本专利技术的有益效果如下：
[0024]本专利技术成功建立了可同时检测艾伯特埃希氏菌O8和O9血清型的O-AGCs的特异性引物对和3重PCR检测方法，该检测体系不仅能在一个PCR反应中同时检测2种血清型，还可
以确定所检测菌株是否为艾伯特埃希菌；同时具有优良的灵敏性和特异性。该引物的发现及方法的建立提升了艾伯特埃希菌的血清分型能力，对于艾伯特埃希菌的监测和后续的流行病学研究具有重要意义。
附图说明
[0025]图1为艾伯特埃希菌EAO8的的O-AGC结构示意图，箭头方向表示基因转录方向。
[0026]图2为艾伯特埃希菌O-AGC结构示意图，箭头方向表示基因转录方向。
具体实施方式
[0027]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。
[0028]实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
[0029]实施例1全基因组测序和生物信息本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于同时检测艾伯特埃希氏菌O8和O9血清型的靶序列，包括：用于检测艾伯特埃希氏菌O8血清型的靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；用于检测艾伯特埃希氏菌O9血清型的靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。2.同时检测艾伯特埃希氏菌O8和O9血清型的特异性引物对，其特征在于，包括：用于检测艾伯特埃希氏菌O8血清型的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；用于检测艾伯特埃希氏菌O9血清型的特异性引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示。3.权利要求2所述的特异性引物对在制备同时检测艾伯特埃希氏菌O8和O9血清型的试剂或试剂盒中的应用。4.一种内参引物与权利要求2所述的特异性引物对配合使用在制备同时检测艾伯特埃希氏菌O8和O9血清型的试剂或试剂盒中的应用，所述内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示。5.一种同时检测艾伯特埃希氏菌O8和O9血清型的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的特异性引物对。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑翰，王红，熊衍文，李群，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：