一种用于鉴别MCR基因分型的试剂盒、鉴别方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴别MCR基因分型的试剂盒、鉴别方法及其应用。所述试剂盒包括SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的引物对及SEQ ID No:3所示探针、SEQ ID No:4和SEQ ID No:5所示的引物对及SEQ ID No:6所示探针、SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的引物对及SEQ ID No:9所示探针，以及SEQ ID No:7和SEQ ID No:10所示的引物对及SEQ ID No:11所示探针。本发明专利技术将mcr

【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴别MCR基因分型的试剂盒、鉴别方法及其应用


[0001]本专利技术属于医疗卫生以及微生物检测领域，特别涉及了一种用于鉴别MCR基因分型的试剂盒、鉴别方法及其应用。

技术介绍

[0002]多黏菌素（polymyxin）是发现于多黏类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）培养液中的抗菌性多肽，有A、B、C、D、E等五种，其中多黏菌素E（colistin）和多黏菌素B（PMB）是临床中最常用的两种多黏菌素。由于其存在一定的神经毒性，在临床上的使用受到严格限制，但在亚洲、欧洲和北美，多黏菌素广泛应用于禽畜养殖业中。根据中国CHINET细菌耐药性监测，由于耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（Carbapenem
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resistant enterobacteriaceae, CRE）的高感染率，多粘菌素作为最后一道防线得到重视，在对CRE菌株感染的危重患者的治疗中，多粘菌素是挽救疗法策略中最为倚重的抗菌药。
[0003]近几年，多粘菌素耐药的肠杆菌科细菌在医学临床不断出现并流行传播，成为全球卫生工作者的关注热点。到目前为止对多粘菌素耐药的CRE涵盖产KPC、NDM、VIM和IMI酶的肠杆菌科细菌。然而近几年在临床、养殖厂、动物性食物、甚至健康人群样本中，均发现对多黏菌素耐药的可转移性耐药性MCR（mobile colistin resistance）基因。其中在2015年的调查中显示，广东省健康人群的肠道菌群中MCR的携带率高达15%，这可能是由于多黏菌素在养殖业中的广泛使用，使得多粘菌素耐药基因通过动物性食品到人群的食物链进入到健康人群体中。最令人担忧的是，mcr
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1可与产KPC、NDM和VIM等碳青霉烯酶的CRE同时存在，形成名副其实的“超级细菌”。这就意味着其极大的阻碍了作为抗革兰阴性菌最后一道防线的多粘菌素的使用。
[0004]mcr
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1基因的可转移性、高携带率和大范围分布引起社会极大的关注和不安。自mcr
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1首次报道以来，已在临床和环境样本中多次发现，全世界范围内共有10类MCR被报道发现，然而目前在临床样本中发现的能通过环境转移并定植于人体内耐药菌的MCR只有mcr
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1、mcr
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3、mcr
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8和mcr
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10，因此这四类MCR基因型可称为影响人类健康的高危型MCR耐药基因。携带mcr
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1基因的细菌并不局限于我国，在东南亚、欧洲、美洲和非洲的30多个国家均有发现。MCR每个基因型可能含有多个基因变异类型，其中mcr
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1已发现多达30种基因变异类型。再者，由于MCR的广泛存在，特别是在健康人群和动物性食品中的存在，使得针对MCR检测现用的选择性筛菌、质谱鉴定菌种、药敏检测和普通PCR验证的检测程序方法变得十分繁复且低效。还有传统的微生物培养法和药敏试验法因耗时长、繁琐的操作过程、对仪器设备要求高等原因未能在临床上大规模推广使用。因此，寻找一种能有效鉴别携带各种MCR基因，特别是对人类健康存在高度危险的四类高危型MCR基因的“超级细菌”的方法迫在眉睫，同时临床上对能快速鉴别与监测目前在临床中流行的四类高危型MCR类型（mcr
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1、mcr
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3、mcr
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8和mcr
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10）的检测方法尤为重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的首要目的在于，提供一种用于鉴别MCR基因分型的试剂盒。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供一种非疾病诊断和治疗用途的鉴别MCR基因分型的方法。
[0007]本专利技术的又一目的在于提供一种如上述的用于鉴别MCR基因分型的试剂盒在临床或环境监测中非疾病诊断和治疗用途的检测MCR基因的应用。
[0008]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：第一方面，一种用于鉴别MCR基因分型的的试剂盒，其包括SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的引物对及SEQ ID No:3所示探针、SEQ ID No:4和SEQ ID No:5所示的引物对及SEQ ID No:6所示探针、SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的引物对及SEQ ID No:9所示探针，以及SEQ ID No:7和SEQ ID No:10所示的引物对及SEQ ID No:11所示探针。
[0009]作为本专利技术提供的所述的用于鉴别MCR基因分型的的试剂盒的一种优选实施方式，所述试剂盒还包括：2
×
PCR缓冲液、Taq酶、dNTP、MgCl2、荧光探针以及FTA试纸片、10%SDS溶液、TE缓冲液。
[0010]作为本专利技术提供的所述的用于鉴别MCR基因分型的的试剂盒的一种优选实施方式，所述试剂盒所述试剂盒为20~50μL荧光PCR反应体系的试剂盒，各组分及其含量如下： PCR反应体系组分终浓度PCR缓冲液1
×
Mg
2＋
浓度2.00mmol/LdNTPs（含dUTP）0.15mmol/LTaq酶2USEQIDNo:1所示引物0.15μmol/LSEQIDNo:2所示引物0.15μmol/LSEQIDNo:3所示探针0.10μmol/LSEQIDNo:4所示引物0.15μmol/LSEQIDNo:5所示引物0.15μmol/LSEQIDNo:6所示探针0.10μmol/LSEQIDNo:7所示引物0.30μmol/LSEQIDNo:8所示引物0.15μmol/LSEQIDNo:9所示探针0.10μmol/LSEQIDNo:10所示引物0.15μmol/LSEQIDNo:11所示探针0.10μmol/L模板2μL补水至20~50μL第二方面，一种非疾病诊断和治疗用途的鉴别MCR基因分型的方法，其包括下述步骤：（1）提取待测样品中的DNA；（2）分别配置具有如上述的4组引物对和4个探针的PCR反应体系；
（3）将步骤（1）提取的DNA作为模板加入到PCR反应体系，进行PCR扩增反应并进行荧光PCR检测；当PCR反应体系中出现单一或多重荧光探针信号时，根据预设的荧光信号对应MCR基因类型鉴别出MCR基因分型；其中不同的预设荧光信号对应不同种类MCR基因类型。
[0011]作为本专利技术提供的所述的非疾病诊断和治疗用途的鉴别MCR基因分型的方法的一种优选实施方式，步骤（1）具体包括如下步骤：取20μL待测样品，置于有直径2.0mmFTA滤膜片的离心管中，然后56℃干燥，干燥后的FTA滤膜片加入10%SDS溶液200μL，煮沸10min，用FTA专用缓冲液洗涤2次，然后再用TE缓冲液洗涤两次，56℃干燥后，可作为PCR反应模板。
[0012]作为本专利技术提供的所述的非疾病诊断和治疗用途的鉴别MCR基因分型的方法的一种优选实施方式，所述试剂盒还包括：2
×
PCR缓冲液、Taq酶、dNTP、MgCl2、荧光探针以及FTA试纸片、10%SDS溶液、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别MCR基因分型的的试剂盒，其特征在于，其包括SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的引物对及SEQ ID No:3所示探针、SEQ ID No:4和SEQ ID No:5所示的引物对及SEQ ID No:6所示探针、SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的引物对及SEQ ID No:9所示探针，以及SEQ ID No:7和SEQ ID No:10所示的引物对及SEQ ID No:11所示探针。2.根据权利要求1所述的用于鉴别MCR基因分型的的试剂盒，其特征在于，还包括：2
×
PCR缓冲液、Taq酶、dNTP、MgCl2、荧光探针以及FTA试纸片、10%SDS溶液、TE缓冲液。3.根据权利要求2所述的用于鉴别MCR基因分型的的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为20~50μL荧光PCR反应体系的试剂盒，各组分及其含量如下：PCR反应体系组分终浓度PCR缓冲液1
×
Mg
2＋
浓度2.00mmol/LdNTPs（含dUTP）0.15mmol/LTaq酶2USEQIDNo:1所示引物0.15μmol/LSEQIDNo:2所示引物0.15μmol/LSEQIDNo:3所示探针0.10μmol/LSEQIDNo:4所示引物0.15μmol/LSEQIDNo:5所示引物0.15μmol/LSEQIDNo:6所示探针0.10μmol/LSEQIDNo:7所示引物0.30μmol/LSEQIDNo:8所示引物0.15μmol/LSEQIDNo:9所示探针0.10μmol/LSEQIDNo:10所示引物0.15μmol/LSEQIDNo:11所示探针0.10μmol/L模板2μL补水至20~50μL。4.一种非疾病诊断和治疗用途的鉴别MCR基因分型的方法，其特征在于，包括下述步骤：（1）提取待测样品中的DNA；（2）分别配置具有如权利要求1所述4组引物对和4个探针的PCR反应体系；（3）将步骤（1）提取的DNA作为模板加入到PCR反应体系，进行PCR扩增反应并进行荧光PCR检...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡双芳，柯跃斌，吕子全，彭长凤，项秋梅，汪洋，沈建忠，
申请(专利权)人：深圳市疾病预防控制中心深圳市卫生检验中心，深圳市预防医学研究所，
类型：发明
国别省市：