一种快速检测庆大霉素高产菌株的分子生物学方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测庆大霉素高产菌株的分子生物学方法，先采用氯化锂和ARTP相结合的方法对生产菌株进行诱变，可产生大量的正突变菌株；然后采用微卫星标记技术，结合琼脂糖凝胶电泳法，以待检测菌种DNA为模板，微卫星标记为引物，经聚合酶链式反应，扩增出大量特异性条带，经过琼脂糖凝胶电泳的检测，去除没有条带的菌落。本发明专利技术实现了对突变菌株的大规模初筛，避开了酶标仪检测，衍生产物不稳定，易分解对数据造成的影响。同时扩大筛选数量，大大提高了筛选效率。可以对绛红色小单孢菌诱变菌株进行大范围筛选，操作简便，筛选范围增大，筛选效率提高，减轻后期筛选力度。减轻后期筛选力度。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测庆大霉素高产菌株的分子生物学方法


[0001]本专利技术涉及一种快速检测庆大霉素高产菌株的分子生物学方法。属于菌种选育


技术介绍

[0002]庆大霉素(Gentamicin，GM)，是一种多组份的氨基糖苷类抗生素，具有耳毒性和肾毒性，在临床上仍然得到广泛应用，需求量较大。庆大霉素最初是在1963年由美国公司的Weinstein等人，从绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)和棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)中分离提纯获得
[1]。紧接着1966年，我国科学家王岳等人分离出来了产庆大霉素的小单胞菌菌株，随后大批量生产。庆大霉素，是由绛红色小单孢菌发酵所得，菌株在连续传代培养中，自身发生衰退，导致庆大霉素产量逐年下降。各实验室一直在进行高产菌株的筛选，传统的自然选育，耗时耗力，本研究使用的是常温等离子体物理诱变(ARTP)和氯化锂化学诱变相结合的方法，获得了较多的高产菌株。氯化锂诱变可以导致AT碱基对与GC碱基对的转换，也可能导致碱基的缺失。ARTP是在高纯N2的保护下，产生的高能粒子能够作用于细胞壁或细胞膜，改变其结构和通透性，进而引起基因损伤，微生物开启SOS修复机制，能够使微生物DNA产生多样性的损伤，正突变率高，并容易获得遗传稳定性较好的突变株，且不产生有毒物质
[2]。
[0003]在绛红色小单孢菌高产菌株筛选中，广泛采用自然选育、诱变育种、基因工程育种等手段。多种正突变率高的育种手段的同时使用，可以产生大量的高产菌株。在庆大霉素产生菌筛选过程中主要采用酶标仪检测技术，而庆大霉素不具有吸收基团，需使用邻苯二甲醛对庆大霉素进行衍生化处理，衍生试剂配制过程要避光，需要现配现用，衍生产物不稳定，见光易分解，受热易分解，需要及时检测，否则结果偏低，影响检测。此方法需要依次进行种瓶孔板和发酵孔板的培育，前后需要5天左右，受时间限制，筛选数量虽较传统的种瓶筛选有较大的增加，但仍然有限。本专利技术缩短了筛选的时间，使用微卫星分子标记技术，对菌株进行特定片段的PCR扩增，经过琼脂糖凝胶电泳检测，找出具有特异性扩增条带的菌株，再经过复筛检测。此方法时间短，避开了产物不稳定的局限性，结果更加准确。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为克服酶标仪检测技术的不足，提供一种快速检测庆大霉素高产菌株的分子生物学方法。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
[0006]一种快速检测庆大霉素高产菌株的分子生物学方法，具体步骤如下：
[0007](1)先将原始菌株诱变获得大量突变菌株，接着将原始菌株与突变菌株作为待测菌株一起测序获得多对有差异的微卫星标记；
[0008](2)然后以待测菌株为模板DNA，步骤(1)所得微卫星标记为引物，进行菌落PCR扩增，扩增出大量特异性条带；
[0009](3)经琼脂糖凝胶电泳检测，去除没有条带的菌落，确定初筛微卫星标记；
[0010](4)另取原始菌株，诱变获得大量突变菌株，利用步骤(3)所得初筛微卫星标记作为引物，进行菌落PCR扩增，筛选出在突变菌株中具有特异性条带，在原始菌株中无特异性条带的，即为高产菌株。
[0011]优选的，步骤(1)中，采用常温等离子体物理诱变(ARTP)和氯化锂化学诱变相结合的方法进行诱变。
[0012]优选的，步骤(3)的具体方法为：经琼脂糖凝胶电泳检测，去除突变菌株和原始菌株均无条带或有条带的引物，留下突变菌株具有此条带，原始菌株无此条带，或者突变菌株无此条带，原始菌株有此条带的，即确定为初筛微卫星标记。
[0013]本专利技术的有益效果：
[0014]本专利技术采用氯化锂和ARTP(ARTP是一种活性粒子，在高纯氮气或氦气的保护下，作用于微生物的细胞壁或者细胞膜，使其通透性发生改变，引起基因的多样性损伤，使微生物DNA发生突变)相结合的方法对生产菌株进行诱变，可产生大量的正突变菌株，孔板筛选虽较种瓶能筛选更多的菌株，但仍有大量的菌株未被选出。微卫星分子标记(Microsatellite markers)，简称SSR，是一种由2
‑
6个碱基对组成的剪短重复序列，具有高度的多态性和广泛的分布等特点，使其成为一种有用的遗传标记
[3]。目前应用于区别不同物种，不同群体，不同基因型个体最有效的标记之一
[4]。微卫星分子标记具有共显性、重复性好、多态性高等优点，广泛应用于动植物的遗传育种中，在微生物领域应用较少。
[0015]本专利技术采用微卫星标记技术，结合琼脂糖凝胶电泳法，以待检测菌种DNA为模板，微卫星标记为引物，经聚合酶链式反应(PCR)，扩增出大量特异性条带，经过琼脂糖凝胶电泳的检测，去除没有条带的菌落，再次对有条带的菌落进行高通量菌种筛选。从而实现了对高产菌株进行前期检测，去除大部分有害突变菌株，留下有益突变菌株，可以增加检测数量，扩大检测基数，增加检出概率。最终筛选出1对微卫星标记，在突变菌株中可以扩增出条带，在原始菌株中不能扩增出条带，检出率达到92.47％，可以用于高产菌株的快速检测。
[0016]本专利技术实现了对突变菌株的大规模初筛，扩大筛选数量，大大提高了筛选效率。可以对绛红色小单孢菌诱变菌株进行大范围筛选，操作简便，筛选范围增大，筛选效率提高，减轻后期筛选力度。微卫星标记技术，减少了孔板筛选的盲目性，前期进行菌种诱变，获得大量的突变菌株，经微卫星标记筛选，去除大量的负突变，留下的为正突变个体，增加准确率。
[0017]筛选工作是菌种筛选的重要环节，根据突变率、假阳性等因素，应该使用筛选速率快、方便、效果好的筛选方法。初筛时样品多，采用简便、准确的检测方法；复筛时可以采用精密的检测法。本专利技术首次将微卫星标记应用于庆大霉素产生菌的突变菌株的筛选上，此方法在96孔板上进行，一板可以检测96个菌株，3小时左右检测完毕，简便高效。
[0018]在庆大霉素产生菌筛选过程中主要采用酶标仪检测技术，而庆大霉素不具有吸收基团，需使用邻苯二甲醛对庆大霉素进行衍生化处理，衍生试剂配制过程要避光，需要现配现用，衍生产物不稳定，见光易分解，受热易分解，需要及时检测，否则结果偏低，影响检测。此方法需要依次进行种瓶孔板和发酵孔板的培育，前后需要5天左右，受时间限制，筛选数量虽较传统的种瓶筛选有较大的增加，但仍然有限。本专利技术缩短了筛选的时间，使用微卫星分子标记技术，对菌株进行特定片段的PCR扩增，经过琼脂糖凝胶电泳检测，找出具有特异
性扩增条带的菌株，再经过复筛检测。此方法时间短，避开了产物不稳定的局限性，结果更加准确。
具体实施方式
[0019]下面结合实施例对本专利技术进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。
[0020]一、实验材料：
[0021]1、绛红色小单孢菌原始菌株为申请人沙土管保存菌株，使用前经16sRNA测序鉴定菌株种类，高产菌株为申请人经过高通量菌种选育技术获得的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测庆大霉素高产菌株的分子生物学方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)先将原始菌株诱变获得大量突变菌株，接着将原始菌株与突变菌株作为待测菌株一起测序获得多对有差异的微卫星标记；(2)然后以待测菌株为模板DNA，步骤(1)所得微卫星标记为引物，进行菌落PCR扩增，扩增出大量特异性条带；(3)经琼脂糖凝胶电泳检测，去除没有条带的菌落，确定初筛微卫星标记；(4)另取原始菌株，诱变获得大量突变菌株，利用步骤(3)所得初筛微卫星标记作为引物，进行菌落PCR扩增，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘阳，张力支，葛祥斌，张卫，王议锋，
申请(专利权)人：福安药业集团烟台只楚药业有限公司，
类型：发明
国别省市：