一种IL10基因敲除小鼠模型及其构建方法、应用技术

本发明专利技术公开了一种IL10基因敲除小鼠模型及其构建方法、应用，构建方法包括以下步骤：S1、基于CRISPR/Cas9技术，确定IL10基因的敲除区域，根据确定的敲除区域设计特异性靶位点gRNA1和gRNA2，gRNA1和gRNA2的基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；S2、将有活性的gRNA1、gRNA2、cas9蛋白显微注射入小鼠受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔获得F0代小鼠；S3、将步骤S2获得的F0代小鼠与野生型小鼠交配，获得的F1代杂合子；S4、将步骤S3获得的F1代杂合子近交获得F2代小鼠即为IL10基因敲除小鼠模型。采用本发明专利技术所述构建发明专利技术不仅能够成功构建IL10基因敲除小鼠模型，且具有周期短、不受小鼠品系限制的优点。的优点。的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种IL10基因敲除小鼠模型及其构建方法、应用


[0001]本专利技术涉及基因敲除小鼠模型构建
，具体涉及一种IL10基因敲除小鼠模型及其构建方法、应用。

技术介绍

[0002]白细胞介素10(IL
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10)是一种具有重要免疫调节功能的抗炎细胞因子。几乎所有的先天和适应性免疫细胞都可以分泌IL10，如巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、上皮细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞等。IL
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10能通过下调单核细胞表面主要组织相容性抗原Ⅱ(MHCⅡ)的表达,降低其抗原递呈作用，进而下调T细胞的激活，抑制炎性细胞的激活、迁移和粘附。同时，IL10与其受体结合后，激活信号通路，可以抑制肿瘤坏死因子α(TNF
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α)和IL
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1、IL
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6、IL
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8及粒
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巨噬细胞集落刺激因子(GM
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CSF)和粒细胞集落刺激因子(G
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CSF)的合成,从而起到抗炎的作用。IL
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10可以通过调节Treg细胞和TH17细胞间的平衡来抑制肿瘤相关炎症。目前，有关基因功能研究最直接有效的方法是建立基因敲除动物模型。
[0003]基因敲除动物模型可以通过基因打靶技术构建和CRISPR/Cas9技术构建。基因打靶技术即建立在ES细胞与DNA同源重组等技术基础上的分子生物学技术。利用同源重组技术对ES细胞特定位点的基因进行改造，通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得修饰的遗传信息经生殖系遗传，获得ES细胞来源的小鼠。因此可以在ES细胞上进行基因编辑，获得基因修饰小鼠。
[0004]ES细胞打靶技术从同源重组载体的构建、到ES细胞的打靶及阳性克隆筛选、再到ES细胞的囊胚注射获得嵌合小鼠，这个过程大约需要4
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6个月时间。而CRISPR/Cas9技术抛开了这部分工作，直接移植注射后的小鼠受精卵获得F0代，大约只需要1个月左右，极大地节省了研发周期和费用。另一方面，通过ES细胞打靶技术获得的基因修饰小鼠，其遗传背景来自于我们选择的ES细胞，而成熟的、可用于基因打靶的ES细胞系通常只有有限的几种品系来源：C57BL/6N、C57BL/6J、129S3以及C57与129的杂交F1系。如果需要其它背景，则需要通过与目的品系野生型小鼠回交的方式获得，回交代数在10代以上。而CRISPR/Cas9技术打破了小鼠品系的限制，可以实现在不同品系、甚至免疫缺陷品系上的遗传修饰，比如：BALB/c、FVB、Nod、Nod
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scid等。
[0005]目前，还没有采用CRISPR/Cas9技术构建IL10基因敲除小鼠模型成功的案例。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种IL10基因敲除小鼠模型的构建方法，采用本专利技术所述构建专利技术不仅能够成功构建IL10基因敲除小鼠模型，且具有周期短、不受小鼠品系限制的优点。
[0007]此外，本专利技术还提供采用上述构建方法构建的IL10基因敲除小鼠模型以及该IL10基因敲除小鼠模型的应用。
[0008]本专利技术通过下述技术方案实现：
[0009]一种IL10基因敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
[0010]S1、基于CRISPR/Cas9技术，确定IL10基因的敲除区域，根据确定的敲除区域设计特异性靶位点gRNA1和gRNA2，gRNA1和gRNA2的基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
[0011]S2、将有活性的gRNA1、gRNA2、cas9蛋白显微注射入小鼠受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔获得F0代小鼠；
[0012]S3、将步骤S2获得的F0代小鼠与野生型小鼠交配，获得的F1代杂合子；
[0013]S4、将步骤S3获得的F1代杂合子近交获得F2代小鼠即为IL10基因敲除小鼠模型。
[0014]IL10基因敲除小鼠模型的构建难点在于异性靶位点gRNA1和gRNA2的设计以及F0代小鼠的基因确定。
[0015]本专利技术基于CRISPR/Cas9技术，通过设计合理的异性靶位点gRNA1和gRNA2基因序列，成功构建了IL10基因敲除小鼠模型，能够在结肠炎、肿瘤、免疫和炎症相关研究中的应用；本专利技术所述构建方法具有周期短、不受小鼠品系限制的优点。
[0016]进一步地，先确定F0代小鼠的基因型，筛选杂合子小鼠与野生型小鼠交配，获得的F1代杂合子。
[0017]进一步地，F0代小鼠的基因型确定过程如下：
[0018]提取F0代小鼠的基因组DNA依次进行PCR扩增和测序鉴定，确认基因型；其中，PCR扩增的引物包括F1、R1、F2和R2，所述F1、R1、F2和R2的基因序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；测序引物的基因序列如SEQ ID NO.7所示。
[0019]IL10基因敲除小鼠模型的构建另一个难点或关键点在于F0代小鼠和F1代杂合子的基因确定。
[0020]本专利技术通过合理设计PCR扩增序列和测序序列，能够成功对F0代小鼠和F1代杂合子的基因进行确定，进一步提高IL10基因敲除小鼠模型的构建的成功率。
[0021]进一步地，获得的F1代杂合子包括2种类型，分别为敲除类型1和敲除类型2，其中，敲除类型1缺失4888个碱基对，敲除类型2缺失4885个碱基对，将敲除类型2的F1代杂合子近交获得F2代小鼠。
[0022]进一步地，F1代杂合子的类型确定过程如下：
[0023]提取F1代小鼠的基因组DNA依次进行PCR扩增和测序鉴定，确认基因型；其中，PCR扩增的引物包括F1、R1、F2和R2，所述F1、R1、F2和R2的基因序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，测序引物的基因序列如SEQ ID NO.7所示。
[0024]进一步地，还包括对F2代小鼠的鉴定，鉴定过程如下：
[0025]分离IL10基因敲除纯合小鼠的骨髓细胞，使用含有M
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CSF的培养液培养细胞，并用LPS刺激后检测巨噬细胞分群，通过RT
‑
QPCR检测巨噬细胞中IL10的表达。
[0026]进一步地，步骤S1中确定的敲除区域为Il10
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201(ENSMUST00000016673.5)转录本的exon2
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exon5。
[0027]采用上述构建方法构建的IL10基因敲除小鼠模型。
[0028]一种IL10基因敲除小鼠模型，敲除区域为Il10
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201(ENSMUST00000本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种IL10基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、基于CRISPR/Cas9技术，确定IL10基因的敲除区域，根据确定的敲除区域设计特异性靶位点gRNA1和gRNA2，gRNA1和gRNA2的基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；S2、将有活性的gRNA1、gRNA2、cas9蛋白显微注射入小鼠受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕雌鼠体内，待其怀孕产仔获得F0代小鼠；S3、将步骤S2获得的F0代小鼠与野生型小鼠交配，获得的F1代杂合子；S4、将步骤S3获得的F1代杂合子近交获得F2代小鼠即为IL10基因敲除小鼠模型。2.根据权利要求1所述的一种IL10基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，先确定F0代小鼠的基因型，筛选杂合子小鼠与野生型小鼠交配，获得的F1代杂合子。3.根据权利要求2所述的一种IL10基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，F0代小鼠的基因型确定过程如下：提取F0代小鼠的基因组DNA依次进行PCR扩增和测序鉴定，确认基因型；其中，PCR扩增的引物包括F1、R1、F2和R2，所述F1、R1、F2和R2的基因序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；测序引物的基因序列如SEQ ID NO.7所示。4.根据权利要求2所述的一种IL10基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，获得的F1代杂合子包括2种类型，分别为敲除类型1和敲除类型2，其中，敲除类型1缺失4888个碱基对，敲除类型2缺失4885个碱基对，将敲除类型2的F1代杂合子近交获得F2代小鼠。5.根据权利要求2所述的一种IL10...

【专利技术属性】
技术研发人员：史培良，郭金龙，辛闻婷，
申请(专利权)人：成都药康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：