一种PD-1敲除的CD19CAR-T细胞的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种PD

【技术实现步骤摘要】
一种PD-1敲除的CD19CAR-T细胞的构建方法


[0001]本专利技术涉及生物工程技术，特别是涉及一种新的PD-1敲除的CD19CAR-T细胞的构建方法。

技术介绍

[0002]CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法)是近年来发展起来的新的过继免疫细胞治疗手段，通过基因工程手段修饰T细胞，使其表达嵌合抗原受体，嵌合抗原受体可以特异性识别肿瘤相关抗原靶点，识别结合后将激活增殖T细胞的信号传递至胞内，引起T细胞激活和增殖，从而有效杀伤肿瘤细胞。CAR分子大致可分为5代演变：I代，特异性T细胞激活；II代，增加共刺激因子，提高细胞毒性；III代，同时具有两个共刺激因子，提高T细胞增殖能力与杀伤毒性；IV代，整合自杀基因，精确调控，细胞因子释放(如IL-7，IL-15)激活等；V代，通用型CAR。与普通的免疫细胞治疗相比，CAR-T技术具有许多独特的优势，如CAR能非MHC依赖性识别肿瘤抗原，不需要经过APC。肿瘤表面蛋白类和脂类抗原都可以作为靶点；有共刺激分子，能有效增强T细胞增殖。因此该技术被认为是有望彻底攻克人类癌症的独特方法。
[0003]目前，CAR-T免疫治疗已在许多临床实验上取得巨大进展。其中，针对B相关抗原CD19阳性的B细胞恶性肿瘤，如急性B-淋巴细胞白血病(B-ALL)，慢性B-淋巴细胞白血病(B-CLL)，B细胞霍奇金氏淋巴瘤(B-HL)和非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)，CAR-T-CD19T细胞免疫治疗疗效显著，已有报告显示CAR-T-CD19治疗在成人和儿童复发和难治性B-ALL中可以获得高达90％的完全缓解率(Complete remission，CR)。研究报告也显示，几种用不同结构设计的CAR-CD19的临床试验治疗都显示了相似的良好疗效。有些患者经CAR-T治疗后还获得了持久性缓解，不需要额外的其他治疗。
[0004]尽管如此，该治疗仍有许多环节需要改进，如能否找到更好的受体、更好的载体、更好的协同刺激分子等，其中转染载体的安全性和有效性对于临床治疗尤为关键。现今，CAR主要的转染模式包括慢病毒、逆转录病毒、电转染等方式，病毒载体尽管具有较好的转染效率，但存在因基因组整合引起插入突变的风险，因此，利用非病毒载体结合电转技术，不需要病毒的介入，可获得与病毒感染效率相当甚至更高的转染结果，避免了病毒核酸随机插入宿主细胞，影响细胞正常生长以及后续可能的病变，是提升CAR-T细胞疗法的安全性的重要环节。亟待研发这一种新的构建CD19CAR-T细胞的方法
[0005]PD-1(programmed death 1)程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子，为免疫球蛋白超家族，是一个268氨基酸残基的膜蛋白。PD1的主要功能是限制外周组织的效应T细胞活性。肿瘤细胞表达的PD1配体和T细胞的PD1结合，抑制T细胞激活相关激酶，从而抑制效应T细胞活性。利用PD1单克隆抗体(MDX-1106、MK3475、CT-011、AMP-224等)，抑制PD1配体和PD1结合，从而达到治疗肿瘤的效果。
[0006]但是，利用PD1抗体的治疗只在黑色素癌疗效较好，对肾癌和肺癌有部分疗效。因为利用抗体进行靶基因的治疗还受到一些因素的限制：(1)抗体的作用只是暂时阻断的作
用；(2)抑制性受体有多种，如何利用多种抗体同时阻断多种抑制性受体还没有对策；(3)不容易研发出有效的抗体；(4)只针对细胞外靶点；(5)抗体药物昂贵等。
[0007]CRISPR-Cas9快速、简便、高效、特异性靶向敲除基因，通过靶向敲除PD1基因，为实现肿瘤免疫治疗提供了一种可行的策略。

技术实现思路

[0008]为此，本专利技术提供一种PD-1敲除的CD19CAR-T细胞的构建方法。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0010]一种PD-1基因敲除的CD19CAR-T细胞的构建方法，所述方法包括：
[0011]确定CD19的单链抗体可变区基因片段，设计合成CD19单链抗体；
[0012]依次连接的CD8信号肽、CD19单链抗体、CD8铰链及跨膜区、胞内4-1BB、胞内CD3ζ融合而成的目的基因连接到pMD 18-Tsimple vector上；
[0013]采用酶切、连接和转化的方法，将目的基因连接到PiggyBac载体上，并测序检测合成正确的目的基因片段产物转入到大肠杆菌感受态TOP10，使含CD19的单链抗体可变区基因片段的PiggyBac载体在大肠杆菌中表达；
[0014]采用Nucleofector细胞核技术，将含有CD19的单链抗体可变区基因片段的PiggyBac载体质粒Piggybac-CAR-CD19，转座酶表达质粒Piggybac Transposase，含有能成功靶向PD1基因的sgRNA表达质粒pGL3-U6-hPD1sg1，以及pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒共转染入T细胞，得到PD-1基因敲除的CD19 CAR-T细胞。
[0015]优选的，所述CD19单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区之间通过连接肽连接，重链可变区包括重链可变区互补决定区1 CDR-H1、重链可变区互补决定区2 CDR-H2和重链可变区互补决定区3CDR-H3；
[0016]轻链包括轻链可变区，轻链包括轻链可变区互补决定区1 CDR-L1、轻链可变区互补决定区2 CDR-L2和轻链可变区互补决定区3 CDR-L3。
[0017]优选的，所述CD19单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0018]优选的，所述CD19单链抗体的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0019]优选的，所述CD8铰链及跨膜区氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0020]优选的，所述胞内4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
[0021]优选的，所述胞内CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
[0022]优选的，所述方法包括将CD19抗原具有特异性的单链抗体片段scFv，myc-tag，CD8来源的跨膜铰链，共刺激因子CD28和4-1BB片段，及细胞内传递信号CD3ζ，然后将CD19-CAR连接到Piggybac载体上。
[0023]优选的，所述含有能成功靶向PD1基因的sgRNA表达质粒pGL3-U6-hPD1sg1质粒的构建过程为：
[0024]设计和合成特异性靶向人PD-1基因的sg RNA寡核苷酸，所述sgRNA在PD-1基因上的靶序列符合5
’-
GGN(19)GG、5
’-
GN(20)GG或者5
’-
N(21)GG的序列排列规则；所述sgRNA在PD-1基因上的靶序列位于基因的外显子；所述sgRNA在PD-1基因上的靶序列位于不同的各种剪切形式的共本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PD-1基因敲除的CD19CAR-T细胞的构建方法，其特征在于，所述方法包括：确定CD19的单链抗体可变区基因片段，设计合成CD19单链抗体；依次连接的CD8信号肽、CD19单链抗体、CD8铰链及跨膜区、胞内4-1BB、胞内CD3ζ融合而成的目的基因连接到pMD 18-Tsimple vector上；采用酶切、连接和转化的方法，将目的基因连接到PiggyBac载体上，并测序检测合成正确的目的基因片段产物转入到大肠杆菌感受态TOP10，使含CD19的单链抗体可变区基因片段的PiggyBac载体在大肠杆菌中表达；采用Nucleofector细胞核技术，将含有CD19的单链抗体可变区基因片段的PiggyBac载体质粒Piggybac-CAR-CD19，转座酶表达质粒Piggybac Transposase，含有能成功靶向PD1基因的sgRNA表达质粒pGL3-U6-hPD1sg1，以及pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒共转染入T细胞，得到PD-1基因敲除的CD19 CAR-T细胞。2.如权利要求1所述的PD-1基因敲除的CD19CAR-T细胞的构建方法，其特征在于，所述CD19单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区之间通过连接肽连接，重链可变区包括重链可变区互补决定区1CDR-H1、重链可变区互补决定区2CDR-H2和重链可变区互补决定区3CDR-H3；轻链包括轻链可变区，轻链包括轻链可变区互补决定区1CDR-L1、轻链可变区互补决定区2CDR-L2和轻链可变区互补决定区3CDR-L3。3.如权利要求1所述的PD-1基因敲除的CD19CAR-T细胞的构建方法，其特征在于，所述CD19单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.如权利要求1所述的PD-1基因敲除的CD19CAR-T细胞的构建方法，其特征在于，所述CD19单链抗体的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。5.如权利要求1所述的PD-1基因敲除的CD19CAR-T细胞的构建方法，其特征在于，所述CD8铰链及跨膜区氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。6.如权利要求1所述的PD-1基因敲除的CD19CAR-T细胞的构建方法，其特征在于，所述胞内4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。7.如权利要求1所述的PD-1基因敲除的CD19CAR-T细胞的构建方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘爽，张青，张普民，
申请(专利权)人：广州重磅生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：