基于tRNA-gRNA-cRNA进行日本青鳉胚胎和细胞的基因编辑系统技术方案

本发明专利技术属于分子生物学领域，利用水稻的tRNA序列构建了tRNA-gRNA系统，该系统在青鳉胚胎和细胞中能在RNA聚合酶启动子CMV的作用下产生具有功能性的gRNA，而不需要在体外先转录gRNA，从而与CRISPR/Cas9系统共同作用对青鳉基因组进行基因编辑。该方法证明了CMV-tRNA-gRNA序列在鱼类细胞和胚胎内能产生有作用的gRNA并和Cas9一起进行基因编辑，同时设计了cRNA-tRNA的策略为多基因靶位能够一步从该策略的模板进行克隆提供了便利，为多基因靶位的同步克隆和敲除提供方案，也为构建稳定的基因敲除细胞系和特定组织敲除的品系提供了一种更便捷的途径。种更便捷的途径。

【技术实现步骤摘要】
基于tRNA-gRNA-cRNA进行日本青鳉胚胎和细胞的基因编辑系统


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种方法，即利用RNA聚合酶启动子CMV在体内驱动tRNA-sgRNA系统稳定表达sgRNA，结合Cas9表达载体或者Cas9蛋白可以在鱼类细胞和胚胎内进行基因编辑。

技术介绍

[0002]成簇规律间隔的短回文序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein，Cas)形成的CRISPR/Cas系统是古生菌体内一种重要的获得性免疫系统(Jinek et al.,2012)。作为该系统的成员之一，经优化的CRISPR/Cas9系统已经发展成为基因编辑技术的有力工具。CRISPR/Cas9系统在实现基因编辑的过程中利用Cas9蛋白在sgRNA的引导下对基因组DNA进行切割，产生非同源末端连接和同源末端修复(Mali et al.,2013；Ran et al.,2013)，从本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在青鳉胚胎或细胞中表达gRNA的序列单元；所述的单元是tRNA、目的基因gRNA和cRNA依次连接而得；所述的tRNA的序列为SEQ ID NO.1、cRNA的序列为SEQ ID NO.2。2.权利要求1所述的序列单元在青鳉胚胎或精原干细胞的基因编辑中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，是将权利要求1所述的1个或2个或3序列单元串联后插入鱼类表达质粒载体，得到的载体与线性化的Cas9 mRNA显微注射入青鳉胚胎或与表达Cas9蛋白的质粒转染精原干细胞；但序列单元为2或3时，所述的序列单元中的目的基因gRNA不同。4.一种青鳉胚胎或细胞的单基因编辑方法，包括下述步骤：1)tRNA、目的基因gRNA和cRNA依次连接，获得tRNA-gRNA-cRNA；所述的tRNA的序列为SEQ ID NO.1、cRNA的序列为SEQ ID NO.2；2)tR...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈天圣，潘启华，蒋月雯，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：