GFRAL细胞外结构域和使用方法技术

本发明专利技术披露了包含结构域D2和D3的GFRAL细胞外结构域。本披露进一步涉及使用本文提供的GFRAL细胞外结构域筛选和评价GFRAL配体诸如GDF15肽的活性的方法和组合物。本发明专利技术还披露了使用本文提供的GFRAL细胞外结构域治疗肥胖、降低食欲和/或减轻体重的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】GFRAL细胞外结构域和使用方法本披露涉及GFRAL细胞外结构域，以及用于使用本文提供的GFRAL细胞外结构域的方法和组合物。本披露进一步涉及用于筛选和评价GFRAL配体(例如，GDF15肽)活性的基于细胞的测定，以及使用GFRAL细胞外结构域和GFRAL配体治疗的方法。还提供了可用于筛选和评价GFRAL配体(例如，GDF15肽)的活性的细胞和试剂盒。
技术介绍
生长分化因子15(GDF15)是转化生长因子-β(TGF-β)细胞因子超家族的一个不同成员，其参与多种生物学功能，包括癌症恶病质、肾和心脏衰竭、动脉粥样硬化和新陈代谢(Breit等人,GrowthFactors[生长因子]2011；29(5):187-95)。最初基于血清中GDF15水平的升高与患有晚期前列腺癌的患者的体重减轻有关这一观察提出了GDF15与体重调节之间的关系(Johnen等人,NatMed[自然医学]2007；13(11):1333-40)。在患有异种移植的前列腺肿瘤的小鼠中，GDF15水平升高还与食物摄入减少介导的体重减轻、脂肪减少和瘦肉组织损失相关，并且能够通过施用GDF15抗体逆转(Johnen等人,NatMed[自然医学]2007；13(11):1333-40)。另外，已经显示在正常和致胖两种饮食条件下，小鼠中GDF15的长期升高表达均会引起食物摄入减少、体重减轻和伴随葡萄糖耐量增强的肥胖(Macia等人,PLoSOne[公共科学图书馆·综合]2012；7(4):e34868)。GDF15在食欲和体重方面的代谢作用使其成为患有肥胖和/或相关合并症的患者的有前途的疗法。GFRAL，神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)受体α家族的孤儿成员，是GDF15的一种高亲和力受体。GFRAL对于GDF15的食欲抑制作用也可能是必需的。GFRAL基因敲除小鼠中消除了GDF15介导的肥胖小鼠的食物摄入减少和体重减轻(Yang等人,NatMed[自然医学]2017；23(10):1158-66)。GFRAL需要与共受体RET结合以响应于GDF15刺激引发细胞内信号传导(Yang等人,NatMed[自然医学]2017；23(10):1158-66)。已经报道了重组GDF15蛋白可作为潜在的治疗剂，并且更多这些蛋白还在研究中(Xiong等人,SciTranslMed[科学转化医学]2017；9(412):eaan8732)。因此，用于快速且有效评价此类治疗性蛋白的活性的测定将是理想的筛选工具。WO2017/121865、WO2017/152105和WO2018/071493中描述了与GDF15和GFRAL有关的测定。同样，用于改进治疗性GDF15组合物活性的新颖方法和组合物也是有益的。
技术实现思路
本披露在各种实施例中提供了用于检测和测试GFRAL配体(例如，GDF15，例如，GDF15肽)的活性的新颖方法和测定。还披露了用于单独使用GFRAL配体(例如，根据本文披露的方法筛选活性的GDF15肽)或使用所述GFRAL配体与可溶性GFRAL(例如，包含D2和D3细胞外结构域但不包含D1细胞外结构域的GFRAL)的组合治疗肥胖和相关障碍的方法和组合物。在各种实施例中，本披露更具体地涉及用于评价GFRAL配体的活性的细胞基方法和测定。与动物基测定相比，细胞基效力测定通常是用于确定生物产品的生物学活性的优选形式，因为细胞基效力测定可以测量产品引起的生物学反应并且可以在相对短的时间内产生结果。另外，许多细胞基效力测定定义了与产品作用机制的相关性。因此，此类测定被广泛使用，并且经常提供给药物管理局以进行药物注册和上市前批准。在各种实施例中，本文披露的所述细胞基方法和测定是细胞基信号转导测定，并且可以用于确定GFRAL配体(例如，GDF15肽)的GFRAL信号传导活性。在各种实施例中，本披露提供了一种检测GDF15肽的活性的方法，所述方法包括：(a)提供表达细胞表面受体激酶的细胞；(b)使所述细胞与所述GDF15肽和可溶性GFRAL接触；以及(c)检测所述经接触细胞中的生物学反应，其中所述可溶性GFRAL包含有包含结构域D2和D3的GFRAL细胞外结构域。在一些实施例中，所述可溶性GFRAL包含缺乏结构域D1的GFRAL细胞外结构域。在一些实施例中，所述可溶性GFRAL进一步包含信号肽。在一些实施例中，所述可溶性GFRAL包含SEQIDNO:1的氨基酸序列或其功能变体。在一些实施例中，所述可溶性GFRAL或功能变体与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述可溶性GFRAL或功能变体与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述可溶性GFRAL包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其功能变体。在一些实施例中，所述可溶性GFRAL或其功能变体，例如包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列的所述可溶性GFRAL或其功能变体，进一步包含(例如，融合至)亲和标签。在一些实施例中，所述亲和标签包含淀粉样β前体蛋白(App)标签、组氨酸(His)标签、FLAG标签或myc标签或者其组合。在一些实施例中，所述可溶性GFRAL包含SEQIDNO:3的氨基酸序列或其功能变体，或者SEQIDNO:25的氨基酸序列或其功能变体。在一些实施例中，所述GDF15肽包含SEQIDNO:13的氨基酸序列或其功能变体，所述氨基酸序列或其功能变体包括SEQIDNO:14、15、16或17的氨基酸序列。在一些实施例中，所述GDF15肽或功能变体与SEQIDNO:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述GDF15肽或功能变体与SEQIDNO:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述GDF15肽包含亲和标签、融合、缀合、PEG化和/或糖基化。在一些实施例中，所述GDF15肽用淀粉样β前体蛋白(App)标签、组氨酸(His)标签、FLAG标签或myc标签或者其组合标记。在一些实施例中，所述GDF15肽与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合。在其他实施例中，所述GDF15肽与脂肪酸缀合。在所述细胞基方法和测定的一些实施例中，使所述细胞同时与所述GDF15肽和所述可溶性GFRAL接触。在一些其他实施例中，使所述细胞依次与所述GDF15肽和所述可溶性GFRAL接触。在一些实施例中，所述GDF15肽和所述可溶性GFRAL处于相同组合物中。在一些实施例中，所述GDF15肽和所述可溶性GFRAL处于混合物中。在一些实施例中，所述GDF15肽和所述可溶性GFRAL处于复合物中。在一些实施例中，所述GDF15肽和所述可溶性GFRAL处于二元复合物中。在所述细胞基方法和测定的一些实施例中，所述细胞表面受体激酶是内源细胞表面受体激酶。在一些其他实施例中，所述细胞表面受体激酶是外源细胞表面受体激酶。在一些实施例中，所述细胞表面受体激酶是RET受体酪氨酸激酶。在所述细胞基方法和测定的一些实施例中，所述细胞不表达内本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测GDF15肽的活性的方法，所述方法包括：/n(i)/n(a)提供表达细胞表面受体激酶的细胞；/n(b)使所述细胞与所述GDF15肽和可溶性GFRAL接触，其中所述可溶性GFRAL包含有包含结构域D2和D3的GFRAL细胞外结构域；以及/n(c)检测所述经接触细胞中的生物学反应；或/n(ii)/n(a)提供表达细胞表面受体激酶以及包含结构域D2和D3的GFRAL细胞外结构域的细胞；/n(b)使所述细胞与所述GDF15肽接触；以及/n(c)检测所述经接触细胞中的生物学反应。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180810 US 62/717,0521.一种检测GDF15肽的活性的方法，所述方法包括：
(i)
(a)提供表达细胞表面受体激酶的细胞；
(b)使所述细胞与所述GDF15肽和可溶性GFRAL接触，其中所述可溶性GFRAL包含有包含结构域D2和D3的GFRAL细胞外结构域；以及
(c)检测所述经接触细胞中的生物学反应；或
(ii)
(a)提供表达细胞表面受体激酶以及包含结构域D2和D3的GFRAL细胞外结构域的细胞；
(b)使所述细胞与所述GDF15肽接触；以及
(c)检测所述经接触细胞中的生物学反应。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述GFRAL细胞外结构域缺乏结构域D1。


3.如权利要求1或2所述的方法，所述方法提供表达细胞表面受体激酶和GFRAL细胞外结构域的细胞，其中
(i)所述GFRAL细胞外结构域是可溶性GFRAL细胞外结构域，或
(ii)所述GFRAL细胞外结构域通过系链与细胞表面附接。


4.如权利要求3所述的方法，其中所述系链
(i)是GFRAL跨膜结构域或其功能片段；
(ii)包含SEQIDNO:18的氨基酸序列或其功能变体；
(iii)是与所述GFRAL细胞外结构域融合的异源跨膜结构域；
(iv)是糖磷脂酰肌醇(GPI)；
(v)包含SEQIDNO:19的氨基酸序列或其功能变体、SEQIDNO:20的氨基酸序列或其功能变体或者SEQIDNO:21的氨基酸序列或其功能变体；
(vi)是膜插入序列；
(vii)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列或其功能变体，或者SEQIDNO:23的氨基酸序列或其功能变体；或
(viii)是膜插入脂肪酸。


5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述GFRAL细胞外结构域进一步包含信号肽。


6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述GFRAL细胞外结构域用选自淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、FLAG标签和myc标签的亲和标签标记。


7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述GFRAL细胞外结构域
(i)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列或其功能变体；
(ii)与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性；
(iii)与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性；
(iv)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其功能变体；
(v)与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性；
(vi)与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性；
(vii)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列或其功能变体；或
(viii)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列或其功能变体。


8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述GDF15肽或其功能变体
(i)包含SEQIDNO:13、14、15、16或17的氨基酸序列或其功能变体；
(ii)与SEQIDNO:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性；或
(iii)与SEQIDNO:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。


9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述GDF15肽
(i)用选自淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、FLAG标签和myc标签的亲和标签标记；
(ii)与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合；
(iii)与脂肪酸缀合；
(iv)具有PEG化；和/或
(v)具有糖基化。


10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述细胞表面受体激酶是(i)内源细胞表面受体激酶；
(ii)外源细胞表面受体激酶；和/或
(iii)RET受体酪氨酸激酶。


11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述细胞不表达
(i)内源GFRAL；
(ii)全长GFRAL；和/或
(iii)内源GDF15。


12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述细胞是包含无效GDF15基因的GDF15敲除(KO)细胞。


13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中
(i)在所述GDF15肽、所述可溶性GFRAL或所述GFRAL细胞外结构域和所述细胞表面受体激酶形成三元复合物时诱导所述生物学反应；
(ii)在所述可溶性GFRAL不存在下与所述GDF15肽接触的细胞中不诱导所述生物学反应；和/或
(iii)所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述GDF15肽和/或所述可溶性GFRAL接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。


14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是RET-ERK、RET-AKT、蛋白激酶C、JAK/STAT、JNK、p38和RAC1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。


15.如权利要求14所述的方法，其中所述细胞表面受体激酶是RET受体酪氨酸激酶，并且所述蛋白是
(i)所述RET-ERK路径中选自以下的细胞内蛋白：ERK1、ERK2、SHC1、FRS2、GRB2、GAB1、GAB2、SOS、SHANK3、GRB7、GRB10、JAK1、JAK2、RAF、RAS、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1和MSK2或其任何下游靶标；或
(ii)所述RET-AKT路径中选自以下的细胞内蛋白：AKT1、AKT2、AKT3、SRC、SHC1、GRB2、CBL、GAB1、GAB2、SHANK3、JAK1、JAK2、RAS、PI3K、PDK1、YAP、BAD、半胱天冬酶-9、FoxO1、FoxO3、FoxO4、IKKα、CREB、MDM2、MLK3、ASK1、p21Cip1、p27Kip1、GSK3α、GSK3β和mTOR或其任何下游靶标。


16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述GDF15肽和/或所述可溶性GFRAL接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。


17.如权利要求16所述的方法，其中
(i)所述蛋白激酶是细胞表面受体激酶；
(ii)所述蛋白激酶和/或细胞表面受体激酶是RET受体酪氨酸激酶；或
(iii)所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。


18.如权利要求16或17所述的方法，其中所述蛋白激酶是
(i)所述RET-ERK路径中选自以下的细胞内蛋白激酶：ERK1、ERK2、JAK1、JAK2、RAF、MEK1、MEK2、RSK1、RSK2、RSK3、MNK1、MNK2、MSK1和MSK2或其任何下游靶标；或
(ii)所述RET-AKT路径中选自以下的细胞内蛋白激酶：AKT1、AKT2、AKT3、SRC、JAK1、JAK2、PI3K、PDK1、MLK3、ASK1、GSK3α、GSK3β和mTOR或其任何下游靶标。


19.一种用于检测GDF15肽的活性的分离和修饰的细胞，其中所述细胞表达包含结构域D2和D3的GFRAL细胞外结构域以及细胞表面受体激酶。


20.如权利要求19所述的细胞，其中所述GFRAL细胞外结构域缺乏结构域D1。


21.如权利要求19或20所述的细胞，其中所述GFRAL细胞外结构域是
(i)可溶性GFRAL细胞外结构域；或
(ii)通过系链附接于细胞表面。


22.如权利要求21所述的细胞，其中所述系链
(i)是GFRAL跨膜结构域或其功能片段；
(ii)包含SEQIDNO:18的氨基酸序列或其功能变体；
(iii)是与所述GFRAL细胞外结构域融合的异源跨膜结构域；
(iv)是糖磷脂酰肌醇(GPI)；
(v)包含SEQIDNO:19的氨基酸序列或其功能变体、SEQIDNO:20的氨基酸序列或其功能变体或者SEQIDNO:21的氨基酸序列或其功...

【专利技术属性】
技术研发人员：白吉荣，K·A·黑尔德魏因，L·D·林德斯利，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH