超高效合相色谱同时测定鱼肝油中VA、VD制造技术

本发明专利技术提供一种超高效合相色谱同时测定鱼肝油中VA、VD

【技术实现步骤摘要】
超高效合相色谱同时测定鱼肝油中VA、VD3的方法
本专利技术涉及药物分析
，具体涉及一种超高效合相色谱同时测定鱼肝油中VA、VD3的方法。
技术介绍
鱼肝油是从鲛类动物等无毒海鱼肝脏中提出的一种脂肪油，其中维生素A、及维生素D3是鱼肝油中主要的营养物质。维生素A(vitaminA，VA)亦名视黄醇，是人体生长发育及维持机体生命活动所不可缺少的脂溶性维生素。维生素A不但可以维持正常的视觉功能防止夜盲症，而且还具有维持上皮细胞结构的完整与健康、促进机体正常生长发育、增强机体的造血功能和预防癌症等十分重要的功能。维生素D3有助于促进小肠粘膜对钙的吸收，能够预防佝偻病和骨样组织钙化障碍等疾病，然而，维生素摄入过量也导致健康风险。因此，测定鱼肝油维生素对评价鱼肝油品质优劣、合理使用鱼肝油具有现实意义。脂溶性维生素的检测有很多种方法：液相色谱法、液相色谱串联质谱法、分光光度法、毛细管电动色谱法等。当前国内外动物肝脏中维生素A及维生素D3含量的测量多采用液相色谱方法来测定。现有方法在标准制备过程中步骤较为繁琐，测定维生素D3时试样经皂化后用石油醚提取，用正相色谱净化，反相色谱分离，外标法定量且每一处理步骤都会对测定结果的准确性带来不同的影响；测试过程耗时长，干扰物质较多，且容易造成维生素被破坏，导致回收率下降。Waters超高效合相色谱(UPC2)是2012年面世的新型正相色谱，它具有传统高效液相色谱和超临界流体色谱的优点，以超临界CO2为主要的流动相，依靠流动相的溶剂化能力来进行分离、分析，既能分析不适用于气相色谱的高沸点、低挥发遇热不稳定的样品，又能提高液相色谱的分析速度和柱效；结合2μm填料技术，使其具有更高的分离能力，更高的分析效率，能够通过精确地调节流动相强度、压力和温度，获得所需的系统分辨率和选择性，对待测物的保留和分离进行有效调控。合相色谱作为一种新技术能够完全替代正相液相色谱，合相色谱分离成本仅为液相色谱的十分之一；其灵敏度比正相液相色谱高，分离效果更好，分析速度快，能够分离液相色谱难以分开的同分异构体组分，还能分析传统液相色谱难保留或难洗脱的成分(比如多糖)。当分析挥发油、油脂类样品时，合相色谱能简化前处理步骤，避免了衍生化，大大提高了检测效率。前国内没有应用超高效合相色谱同时检测鱼肝油中维生素A及维生素D3含量的文献报道。
技术实现思路
根据现有技术的不足，本专利技术采用超高效合相色谱法测定鱼肝油中维生素A及维生素D3含量，样品经前处理用正己烷溶解后上样，能够大大简化样品预处理步骤，缩短分析时间，具有预处理简单、耗时短、灵敏度高、回收率高等优点，为复合鱼肝油制剂的质量控制提供一种新方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一方面，本专利技术提供一种超高效合相色谱同时测定鱼肝油中VA、VD3的方法，步骤如下：步骤1)取鱼肝油样品，加入溶剂一溶解后，皂化，萃取，合并有机层，水洗有机层至中性，将有机相干燥后浓缩，浓缩物用溶剂二定容后，过滤，即得待测液；步骤2)精密吸取待测液用超高效合相色谱仪检测，实现同时定量和定性检测鱼肝油中VA、VD3。进一步地，所述超高效合相色谱仪的检测条件如下：色谱柱：WatersAcquityUPC2Torus1-AA(100mm×3.0mm，1.7μm)，流动相：A为超临界CO2；流动相B为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈中的一种。进一步地，所述超高效合相色谱仪的检测条件如下：流动相A与流动相B的体积比为85∶15，采用等梯度洗脱，采集时间3min；流速1mL/min；进样量1μL；柱温50℃；维生素D3检测波长265nm，维生素A检测波长为325nm；动态背压(ABPR)：10MPa。进一步地，所述定性方法是指：鱼肝油样品中VA、VD3的保留时间与VA、VD3标准品的保留时间一致；所述定量方法是指以待测物峰面积对比标准物峰面积对应标准曲线中的浓度为实测浓度。进一步地，所述标准曲线的绘制过程如下：步骤A)VA标准溶液的制备：称取维生素A标准品，通过色谱级正己烷震荡溶解定容，再进行移液，过滤、得到一系列不同浓度的维生素A标准液；步骤B)VD3标准溶液的制备：称取维生素D3标准品，通过色谱级正己烷震荡溶解定容，再进行移液，过滤、得到一系列不同浓度的维生素D3标准液；步骤C)分别将VA、VD3标准溶液注入超高效合相色谱仪中进行检测，将不同浓度的峰面积绘制对应的标准曲线。进一步地，所述VA标准溶液的浓度分别为500ppm、200ppm、100ppm、50ppm、20ppm、10ppm、5ppm。进一步地，所述VD3标准溶液浓度分别为500ppm、200ppm、100ppm、50ppm、20ppm、10ppm、5ppm。进一步地，步骤1)中，所述溶剂一为无水乙醇，所述溶剂二为正己烷。进一步地，步骤1)中，所述皂化采用氢氧化钾溶液，其浓度为1g/mL；所述皂化条件为50-60℃水浴15-45分钟，优选为30分钟。进一步地，步骤1)中，所述萃取采用石油醚进行，萃取过程中采用震荡萃取方式。进一步地，步骤1)所述干燥采用无水硫酸钠。进一步地，步骤1)中所述有机相在30-40℃浓缩至残留物剩余2mL，采用氮气吹干，得到浓缩物。进一步地，所述过滤采用0.22μm有机滤膜过滤。一方面，本专利技术提供一种超高效合相色谱同时测定鱼肝油中VA、VD3的方法，步骤如下：1)维生素A标准品母液配制：称取维生素A标准品2mg于2ml离心管中，色谱级正己烷溶解定容，得到浓度为1000ppm的标准母液；2)维生素A标准系列溶液配制：得到的标准母液用移液管分别准确移取0.5mL、0.2mL、0.1mL、50μL、20μL、10μL、5μL、2μL至1mL容量瓶中，正己烷定容，过滤得到500ppm、200ppm、100ppm、50ppm、20ppm、10ppm、5ppm的一系列不同浓度标准液；3)维生素D3标准品母液配制：称取维生素A标准品2mg于2ml离心管中，色谱级正己烷溶解定容，得到浓度为1000ppm的标准母液；4)维生素A标准系列溶液配制：得到的标准母液用移液管分别准确移取0.5mL、0.2mL、0.1mL、50μL、20μL、10μL、5μL、2μL至1mL容量瓶中，正己烷定容，过滤得到500ppm、200ppm、100ppm、50ppm、20ppm、10ppm、5ppm的一系列不同浓度标准液；5)溶解：准确称取鱼肝油样品1-2g于50mL具塞离心管中，加入无水乙醇3-6ml；6)皂化：加入1g/ml的氢氧化钾溶液2-4ml于步骤(1)的具塞离心管中，上下摇晃，混匀，在60℃水浴锅中皂化30分钟，取出后立即冷却至室温；7)提取：将皂化液转入分液漏斗，向分液漏斗中加入5ml的石油醚，进行震荡萃取，静置分层后将下层溶液转移至另一分液漏斗；8)洗涤：将步骤(7)重复2-3次，合并醚层。用15ml本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种超高效合相色谱同时测定鱼肝油中VA、VD

【技术特征摘要】
1.一种超高效合相色谱同时测定鱼肝油中VA、VD3的方法，其特征在于，步骤如下：
步骤1)取鱼肝油样品，加入溶剂一溶解后，皂化，萃取，合并有机层，水洗有机层至中性，将有机相干燥后浓缩，浓缩物用溶剂二定容后，过滤，即得待测液；
步骤2)精密吸取待测液用超高效合相色谱仪检测，实现同时定量和定性检测鱼肝油中VA、VD3。


2.根据权利要求1所述超高效合相色谱同时测定鱼肝油中VA、VD3的方法，其特征在于，所述超高效合相色谱仪的检测条件如下：
色谱柱：WatersAcquityUPC2Torus1-AA，规格为100mm×3.0mm，1.7μm；
流动相A为超临界CO2；流动相B为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈中的一种。


3.根据权利要求2所述超高效合相色谱同时测定鱼肝油中VA、VD3的方法，其特征在于，所述超高效合相色谱仪的检测条件如下：流动相A与流动相B的体积比为85∶15，采用等梯度洗脱，采集时间3min；流速1mL/min；进样量1μL；柱温50℃；维生素D3检测波长265nm，维生素A检测波长为325nm；动态背压：10MPa。


4.根据权利要求1所述超高效合相色谱同时测定鱼肝油中VA、VD3的方法，其特征在于，所述定性方法是指：鱼肝油样品中VA、VD3的保留时间与VA、VD3标准品的保留时间一致；所述定量方法是指以待测物峰面积对比标准物峰面积对应标准曲线中的浓度为实测浓度。


5.根据权利要求4所述超高效合相色谱同时测定鱼肝油中VA、VD3的方法，其特征在于，所述标准曲线的绘制过程如下：
步骤A)VA标准溶液的制备：称取维生素A标准品，通过色谱级正己烷震荡溶解定容，再进行移液，过滤、得到一系列不同浓度的维生素A标准液；
步骤B)VD3标准溶液的制备：称取维生素D3标准品，通过色谱级正己烷震荡溶解定容，再进行移液，过滤、得到一系列不同浓度的维生素D3标准液；
步骤C)分别将VA、VD3标准溶液注入超高效合相色谱仪中进行检测，将不同浓度的峰面积绘制对应的标准曲线。


6.根据权利要求5所述超高效合相色谱同时测定鱼肝油中VA、VD3的方法，其特征在于，所述VA标准溶液的浓度分别为500ppm、200ppm、100ppm、50ppm、20ppm、10ppm、5ppm；
所述VD3标准溶液浓度分别为500ppm、200ppm、100ppm、50ppm、20ppm、10ppm、5ppm。


7.根据权利要求1所述超高效合相色谱同时测定鱼肝油中VA、VD3的方法，其特征在于，步骤1)中，所述溶剂一为无水乙醇，所述溶剂二为正己烷；
步骤1)中，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴鹏，唐旭，徐长安，林春波，刘源森，林凌，
申请(专利权)人：自然资源部第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35