PEAR1基因突变试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及PEAR1基因突变试剂盒及其应用，所述试剂盒中包括TALEN内切酶或者编码TALEN内切酶的质粒。本发明专利技术的PEAR1基因突变试剂盒能够成功地对PEAR1基因进行突变，通过突变能够降低PEAR1蛋白活性，通过降低PEAR1蛋白活性，有助于提高肺栓塞的存活率。

【技术实现步骤摘要】
PEAR1基因突变试剂盒及其应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及PEAR1基因突变试剂盒及其应用。
技术介绍
血小板内皮聚集受体1(plateletendothelialaggregationreceptor-1,PEAR1)是一种含有1034个氨基酸的跨膜蛋白，主要在巨核细胞、血小板和内皮细胞上表达。PEAR1在细胞外含有EMI结构域(蛋白-蛋白相互作用区域)，15个类似表皮生长因子的重复序列及胞质内多个酪氨酸和脯氨酸残基组成。基于人群的多项研究中，多个独立的研究发现PEAR1基因可调控血小板功能并参与血栓相关事件的发生。其中多个全基因组关联研究(Genome-Wide-Association-Studies,GWAS)发现PEAR1基因突变可影响血小板的聚集能力。JurajSokol等人研究发现PEAR1单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNPs)可增加粘性血小板综合征的发病率，另一项研究纳入101例肺栓塞患者和匹配的132例健康人群，发现PEAR1基因rs778026543突变在肺栓塞患者与健康人群之间存在显著性差异。而在动物水平的研究中，Maarten等人通过PEAR1基因敲除小鼠实验，发现硫酸葡聚糖可以直接在体外活化PEAR1引起浓度依赖的血小板聚集，但是在体内的尾出血及静脉血栓中PEAR1基因未体现明显区别。其PEAR1基因敲除小鼠采用国际小鼠表型联盟基于C57BL/6N为背景的PEAR1基因敲除小鼠Pear1tm1a(KOMP)Wts，其使用Cre/loxP和Flp/FRT系统敲除PEAR1基因的7号和8号外显子构成PEAR1基因移码敲除小鼠模型，如图1所示。因此目前尚未有PEAR1基因突变的体外模型可以模拟人群中PEAR1基因突变对于血栓性疾病的作用。
技术实现思路
为了对PEAR1基因进行突变以及提供一种治疗肺栓塞的药物试剂盒，本专利技术提供PEAR1基因突变试剂盒及其应用。具体而言，为了实现本专利技术的目的，本专利技术拟采用如下的技术方案：本专利技术一方面涉及PEAR1基因突变试剂盒，所述试剂盒中包括TALEN内切酶或者编码TALEN内切酶的质粒，所述TALEN内切酶的靶点位置选自下述PEAR1-T1和/或PEAR1-T4；PEAR1-T1：TCACCACGACCACTAAGGagtcccacctgcgccccttCAGCCTGCTCCCAGCTGA；PEAR1-T4TGGACTCCCGCCCACGCctgcagtgctgtaggGGTTACTACGAGAGCAGA。在本专利技术的一个优选实施方式中，所述PEAR1基因突变是指在TGCGCCCTTCAG前缺失两个碱基CC或缺失11个碱基TCCCACCTGCG。在本专利技术的一个优选实施方式中，所述的试剂盒还包括基因突变成功的鉴定引物组，所述引物组包括：PEAR1-sens：TGAGTACTGATTCTCTCCATGGTG；PEAR1-anti：AACTGAAGGAGCAGACAGTAGC。本专利技术另一方面还涉及上述试剂盒在制备PEAR1基因突变小鼠中的应用。本专利技术另一方面还涉及一种治疗肺栓塞的药物试剂盒，所述试剂盒包括上述PEAR1基因突变试剂盒以及治疗肺栓塞的药物。优选地，所述治疗肺栓塞选自替格瑞洛、氯吡格雷、利伐沙班、达比加群、阿哌沙班抗血栓药中的一种或者多种。本专利技术另一方面涉及上述药物试剂盒在制备治疗肺栓塞和/或抑制凝血药物中的应用。在本专利技术的一个优选实施方式中，所述药物能够减少肺部栓塞的同时提高存活率。本专利技术另一方面涉及PEAR1基因突变试剂或PEAR1基因敲除试剂在制备治疗肺栓塞和/或抑制凝血药物中的应用。对于本专利技术的PEAR1基因突变试剂或PEAR1基因敲除试剂，本领域的技术人员能够根据PEAR1的基因序列采用公知的方法确定。在本专利技术的一个优选实施方式中，所述PEAR1基因突变试剂或PEAR1基因敲除试剂能够减少肺部栓塞的同时提高存活率。本专利技术另一方面还涉及以PEAR1基因及其受体为靶点的试剂盒在制备治疗肺栓塞和/或抑制凝血药物中的应用。本专利技术另一方面还涉及PEAR1基因突变小鼠在用于筛选治疗肺栓塞的药物中的应用。有益效果本专利技术的PEAR1基因突变试剂或基因敲除能够成功地对PEAR1基因进行突变，通过突变能够降低PEAR1蛋白活性，通过降低PEAR1蛋白活性，有助于提高肺栓塞的存活率。附图说明图1是示出TALEN质粒的示意图。图2(a)是示出(a)LuciferaseSSA检测TALEN活性原理的图；图2(b)是示出与参照比较，TALEN活性比值情况的图。图3是示出PEAR1TALEN的SSA活性结果的图。图4是示出免疫蛋白印迹方法检测WT、Founder1系、Founder7系PEAR1表达的图。图5是示出PEAR1基因移码突变小鼠基因检测结果的图。图6是示出PEAR1基因敲除小鼠免疫印迹结果的图。图7是示出肺栓塞实验PEAR1-/-小鼠与WT小鼠存活率对比的图。图8(a)是示出肺栓塞小鼠肺部病理(a)WT小鼠正常肺部的图；图8(b)是示出PEAR1-/-小鼠正常肺部的图；图8(c)是示出WT小鼠肺栓塞的图；图8(d)是示出WT小鼠给予替格瑞洛1小时后肺栓塞的图；图8(d)是示出PEAR1-/-小鼠肺栓塞的图；图8(e)是示出PEAR1-/-小鼠给予替格瑞洛1小时后肺栓塞的图。图9是示出尾出血实验PEAR1-/-小鼠与WT小鼠尾出血时间对比的图。具体实施方式为了进一步理解本专利技术，下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。如无特殊说明，本专利技术实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。实施例11.PEAR1基因敲除小鼠构建策略及质粒构建参考PEAR1基因组数据，发现PEAR1基因存在多个转录产物，对转录产物及蛋白保守区域进行分析，设计出能特异性识别PEAR1基因外显子功能区域DNA的TALEN内切酶，用TALEN内切酶剪切PEAR1基因组DNA，诱发DNA损伤，在同源重组修复过程中形成突变的位置，TALEN质粒如图1所示。2.TALEN的SSA活性检测TALEN质粒构建，根据PEAR1基因转录产物和蛋白保守区分析，移码突变设计从第一个保守区“EMI”前开始，因此TALEN靶点设计在ATG开始的公共外显子2或者3上。TALEN质粒构建完成后，采用SSALuciferase报道的基因方法检测其活性。LuciferaseSSA检测TALEN活性原理：终止子位于luciferase的编码区的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.PEAR1基因突变试剂盒，所述试剂盒中包括TALEN内切酶或者编码TALEN内切酶的质粒，所述TALEN内切酶的靶点位置选自下述PEAR1-T1和/或PEAR1-T4；/nPEAR1-T1：/nTCACCACGACCACTAAGG agtcccacctgcgcccctt CAGCCTGCTCCCAGCTG A；/nPEAR1-T4/nTGGACTCCCGCCCACGC ctgcagtgctgtagg GGTTACTACGAGAGCAGA。/n

【技术特征摘要】
1.PEAR1基因突变试剂盒，所述试剂盒中包括TALEN内切酶或者编码TALEN内切酶的质粒，所述TALEN内切酶的靶点位置选自下述PEAR1-T1和/或PEAR1-T4；
PEAR1-T1：
TCACCACGACCACTAAGGagtcccacctgcgccccttCAGCCTGCTCCCAGCTGA；
PEAR1-T4
TGGACTCCCGCCCACGCctgcagtgctgtaggGGTTACTACGAGAGCAGA。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述PEAR1基因突变是指在TGCGCCCTTCAG前缺失两个碱基CC或缺失11个碱基TCCCACCTGCG。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，所述的试剂盒还包括基因突变成功的鉴定引物组，所述引物组包括：
PEAR1-sens：TGAGTACTGATTCTCTCCATGGTG；
PEAR1...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔一民，向倩，王哲，胡琨，常国栋，
申请(专利权)人：北京大学第一医院，
类型：发明
国别省市：北京;11