一种稳定高效的强寄生性原生生物芸薹根肿菌单孢分离方法技术

本发明专利技术提出了一种稳定高效的强寄生性原生生物芸薹根肿菌单孢分离方法，先用改进的蔗糖梯度离心法制备较纯的孢子悬浮液，借助血球计数板计算孢悬液浓度，基于一定浓度的孢悬液的基础上，利用琼脂分块平面毛细管印迹法获取单休眠孢子，继而接种到ECD系统中易感品种ECD‑05催芽2～3d的健壮根毛上。与前人相关研究方法相比，主要克服了显微镜下单孢微小不易定位，液滴法视野分层过多且易干燥而无法吸取及显微操作无法精确挑取单孢等问题。平面毛细管印迹法结合可大大缩小显微镜镜检时需检查的视野范围，且分块的琼脂易于抓取，此外不需要先进的自动化仪器设备，可操作性强，可以显著提高单孢分离的效率。

【技术实现步骤摘要】
一种稳定高效的强寄生性原生生物芸薹根肿菌单孢分离方法
本专利技术属于微生物单孢分离
，尤其涉及一种无法在人工培养基培养的强寄生性原生生物芸薹根肿菌单休眠孢子的分离技术。
技术介绍
十字花科植物根肿病是由芸薹根肿菌(PlasmodiophorabrassicaeWoronin)侵染引起的一种世界性土传病害，是十字花科植物的重要根部病害。芸薹根肿菌(P.brassicae)是一种专性活体寄生菌，1995年Ainsworth正式将根肿菌归入原生生物界根肿菌属。研究表明，根肿菌由于生理小种差异存在致病性分化，自然存在的群体常高度混杂。Mananares等发现现有的寄主鉴别法确定的生理小种内还能够细分出致病型，提出只有采用单孢菌系进行的检测结果才更接近小种的真实致病能力(Manzanares-Dauleuxetal.,2001)。因此，在进行抗病性遗传分析的过程中，采用单孢分离、寄主扩繁、建立根肿菌单孢系鉴定根肿菌生理小种(singlesporeisolates,SSI)的方法所获得的鉴定结果更具有参考价值。病原微生物的单孢分离和接种办法，归纳起来主要有以下四种：一是自动体系，其运用于根肿菌的单孢分离在一定条件下的成功率可以达到40％～50％；但其运用受实验室的条件制约；二是直接的毛细管法，但比较适合能在人工培养基生长并且长出菌丝的微生物；三是玻璃针法，制作要求的环境条件高，且应用受制于孢子大小的要求(要在解剖镜下可见)，操作也较为繁琐；四是方便快捷的涂布平板法，却不适用于强寄生性的根肿菌的分离。另外，针对根肿菌的单孢分离也有报道，主要有毛细管打孔法，印痕法以及稀释液滴法，这些方法单独来看都具有一定的理论支持，但大都费时费力，可操作性不佳，分离难度大。如毛细管打孔法，需要稳定的显微操作，且带单孢的水琼脂一面难以取出沾染根毛，印痕法一个单孢的获取需要多次转移及检查，稀释液滴法在镜检时液滴分层多需要不断调整焦距细致查找，且放大倍数大的情况下需要调整玻片位置反复检查多个视野。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术的目的在于建立一种稳定高效的强寄生性原生生物芸薹根肿菌单孢分离方法，在无特殊设备要求的情况下，能实现简单，方便，稳定，高效的分离微小的无法在人工培养基生长的单休眠孢子。本专利技术的技术方案的实现如下述：(A)根瘤洗净，腐熟后，表面消毒，榨成匀浆，经过过滤和密度梯度离心，得到浓缩的纯净孢悬液。(B)配制2％g/ml水琼脂溶液，并于灭菌的罐头瓶中煮沸至完全透明无气泡。移液枪吸取1ml至载玻片(提前置于烘箱中烘30min以上)上，快速盖上尺寸盖玻片，制备若干水琼脂平面(可置于铺有湿润滤纸的10cm*10cm塑料培养皿中封口保存约d)。(C)血球计数板计算浓缩孢悬液浓度，无菌水稀释，制备浓度为105～106/ml的印迹液。(D)干净锋利的手术刀灼烧灭菌，将琼脂平面切除厚度不均的边缘，随后分块为1～3mm的小块，进而用内径0.3mm的毛细管吸取一定量涡旋均匀的上述步骤(C)的印迹液，在水琼脂废料上印迹几次，保证随后印迹的稳定性，保持毛细管水平或者略向上倾斜15°角，琼脂平面与毛细管成垂直的状态下，对每个小块印迹。(E)将印迹好的琼脂平面块于显微镜下寻找带有单孢的琼脂块，定位到疑似单孢，在低倍数下检查印迹周围是否干净，只带有单个孢子。部分存在干扰质的目标在高倍数下检查确认有且只有一个单孢无误。(F)上述(E)得到的单孢用尖头镊子在10×/5×物镜下抓取，暂时转移到置于铺有湿润滤纸的塑料培养皿中的盖玻片上，待到检查完一整张琼脂平面，将所得所有单孢接种到健壮的2～3日龄ECD-05幼苗根毛上。进一步地，所述步骤(A)中，根瘤必须达到含有丰富休眠孢子的发病时期，在此基础上，根瘤越多，提取得到的孢子沉淀越多，易于与上清的分离。进一步地，所述密度梯度离心为：加清水离心2次，取沉淀溶于5ml50wt％的蔗糖溶液离心，取上清及最外层趋于溶解的米白色沉淀，加无菌水离心重复2～3次，直至上清达澄澈。最后得到的沉淀溶于10-15ml无菌水中。进一步地，步骤(B)中制备水琼脂平面尽量操作快速，平面尽量无气泡且厚度均匀。载玻片和10cm*10cm塑料培养皿可以放在55℃的烘箱中预热30min。进一步地，步骤(C)中印迹液浓度必须控制在105～106/ml范围内，与一张玻片上含有单孢的琼脂块的数量密切关联，孢子悬浮液的浓度可以由血球计数板计算，并稀释至该浓度范围。进一步地，所述步骤(D)中，在印迹前，先在水琼脂废料上印迹几次，保证随后印迹的稳定性。进一步地，步骤(D)所用毛细管内径0.3mm，在20×物镜下基本涵盖了印迹圈，不需要过多移动载物台即可完成一个小块的检查。步骤(E)单孢的琼脂块在不同放大倍数下的确认方式，需依据根肿菌休眠孢子大小，形状，及调焦过程呈现的微泛蓝光等特征，优选为：在20×物镜下寻找带有单孢的琼脂块，在10×物镜下检查印迹周围是否干净，在40×物镜下检查确认有且只有一个单孢无误。而多孢子的琼脂块一经确认无需多看直接舍弃。进一步地，单孢小块转移到铺有湿润滤纸的塑料培养皿中的盖玻片上暂存，暂存时要保证湿度。步骤(F)中单孢小块的暂存要保证湿度防止干燥后无法夹取以及琼脂平面肉眼不可见，接种时注意含有单孢的平面接触根毛。步骤(F)中接种后的幼苗仍保留在铺有湿润滤纸的3.5cm小培养皿中，25℃黑暗条件下共培养48h。所述所有步骤中器具需灭菌及一定温度烘干以保证无根肿菌污染，且互相之间一一隔离防止相互污染。本专利技术提出了一种稳定高效的强寄生性原生生物芸薹根肿菌单孢分离方法，先用改进的蔗糖梯度离心法制备较纯的孢子悬浮液，借助血球计数板计算孢悬液浓度，基于一定浓度的孢悬液的基础上，利用琼脂分块平面毛细管印迹法(capillaryprintonagarpiecesplane)获取单休眠孢子(singlerestingspore)，继而接种到ECD系统中易感品种ECD-05催芽2～3d的健壮根毛上。与前人相关研究方法相比，主要克服了显微镜下单孢微小不易定位，液滴法视野分层过多且易干燥而无法吸取及显微操作无法精确挑取单孢等问题。平面毛细管印迹法结合可大大缩小显微镜镜检时需检查的视野范围，且分块的琼脂易于抓取，此外不需要先进的自动化仪器设备，可操作性强，可以显著提高单孢分离的效率。附图说明图1为需要的物品及重要步骤的图解(A-J)，A为所需物品，B为2％水琼脂，C为琼脂平面的制备冷却过程示意图，D为合格的琼脂平面，E为分块后的琼脂，F为毛细管印记过程示意图，G为印迹后正在沉降的琼脂小块，H为显微镜观察后确认有且只有一个休眠孢子的琼脂小块，I为单孢接种到健壮的2～3日龄ECD-05幼苗根毛示意图；J为接种单孢后正在水培的ECD05植株。图2为显微镜下单孢(B、C)与多孢子(A、D)的印迹琼脂小块(白色箭头标示孢子所在位置)。图3为不同浓度印迹液印迹的平均每单孢镜检耗时(A)及琼脂小块单孢占比本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种稳定高效的强寄生性原生生物芸薹根肿菌单孢分离方法，其特征在于，包括下述步骤：/n(A)将强寄生性原生生物芸薹病根根瘤洗净，腐熟后，表面消毒，榨成匀浆，经过过滤和密度梯度离心，得到浓缩的纯净孢悬液。/n(B)配制2％g/ml水琼脂溶液，并于灭菌的罐头瓶中煮沸至完全透明无气泡。然后移液枪吸取1ml至载玻片上，快速盖上盖玻片，制备若干水琼脂平面。/n(C)血球计数板计算浓缩孢悬液浓度，无菌水稀释，制备浓度为10

【技术特征摘要】
1.一种稳定高效的强寄生性原生生物芸薹根肿菌单孢分离方法，其特征在于，包括下述步骤：
(A)将强寄生性原生生物芸薹病根根瘤洗净，腐熟后，表面消毒，榨成匀浆，经过过滤和密度梯度离心，得到浓缩的纯净孢悬液。
(B)配制2％g/ml水琼脂溶液，并于灭菌的罐头瓶中煮沸至完全透明无气泡。然后移液枪吸取1ml至载玻片上，快速盖上盖玻片，制备若干水琼脂平面。
(C)血球计数板计算浓缩孢悬液浓度，无菌水稀释，制备浓度为105～106/ml的印迹液。
(D)切除琼脂平面厚度不均的边缘，随后分块为1～3mm的小块，进而用内径0.3mm的毛细管吸取一定量涡旋均匀的步骤(C)的印迹液，保持毛细管水平或者倾斜15°角，琼脂平面与毛细管成垂直的状态下，对每个小块印迹。
(E)将印迹好的琼脂平面块于显微镜下寻找带有单孢的琼脂块，定位到疑似单孢，在低倍数下检查印迹周围是否干净，只带有单个孢子。部分存在干扰质的目标在高倍数下检查确认有且只有一个单孢无误。
(F)利用尖头镊子在显微镜下抓取单孢，并转移到铺有湿润滤纸的塑料培养皿中的盖玻片上，待到检查完一整张琼脂平面，将所得所有单孢接种到健壮的2～3日龄ECD05幼苗根毛上。
(G)接种后的ECD05暗培养48h，水培21d，基质培养42d以后检查发病情况继续继代扩繁。
(H)表型观察结合PCR检测确...

【专利技术属性】
技术研发人员：余小林，高莹莹，章艺，李荣荣，于书博，刘楷文，钟可嘉，赵坤，
申请(专利权)人：浙江大学，无锡迪茉得生物种业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33