一种基于间充质干细胞的融合癌细胞膜仿生纳米粒及其制备方法技术

本发明专利技术属于药物制剂技术领域，涉及一种基于间充质干细胞的融合癌细胞膜仿生纳米粒，尤其是一种基于间充质干细胞融合癌细胞膜的靶向肿瘤及骨转移性肿瘤的仿生纳米粒（简称TB@NP）及其制备方法与应用。本发明专利技术的仿生纳米粒为载药纳米粒，由一层融合细胞膜包覆，融合膜由间充质干细胞膜和癌细胞膜组成，制成可靶向肿瘤及肿瘤骨转移部位的仿生纳米递药系统。所述仿生纳米粒可为无机纳米粒和有机纳米粒，包载的药物可为基因药物和小分子药物等。经体内外实验验证该仿生纳米递送系统可精准地将药物递送至肿瘤及肿瘤骨转移部位，靶向性强且安全性良好，可增强药物疗效并减轻毒副作用，具有较高的临床实践意义。

【技术实现步骤摘要】
一种基于间充质干细胞的融合癌细胞膜仿生纳米粒及其制备方法
本专利技术属于药物制剂
，具体涉及一种基于间充质干细胞融合癌细胞膜的靶向肿瘤及骨转移性肿瘤的仿生纳米粒(简称TB@NP)及其制备方法与应用。
技术介绍
现有技术公开了肿瘤是严重威胁全世界人民的生存与健康的疾患，有关统计显示所述疾患每年的发病率和死亡率居高不下，仅次于心脑血管疾病。研究显示，在肿瘤的进展过程中，大多会发生转移，其中骨是肿瘤转移的好发部位，其中，前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌，肾癌，肺癌，肝癌，宫颈癌，直肠癌等多种癌症均易发生骨转移；尤其是前列腺癌和乳腺癌，骨转移占转移性前列腺癌和乳腺癌的65-80％，一经发生骨转移，其造成的病理性骨折，骨痛，高钙血症，脊髓和神经压迫等一系列骨相关事件(SREs)严重危害患者的生命健康，一般难以治愈。目前用于治疗骨转移的骨保护制剂如双膦酸盐，镭233等虽然可延缓骨转移的进展，但还是难以达到治愈的目的。细胞膜包覆的纳米粒作为一种新兴的仿生纳米粒，具有良好的生物相容性和安全性。同时，由于细胞膜继承了同源细胞完整的膜识别系统，根据细胞来源的不同将具有不同的靶向能力和相应的生物功能。研究显示了间充质干细胞是来源于骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血的一种多功能干细胞，其对肿瘤、炎症、损伤尤其是骨髓部位有天然的归巢能力，此外，不同的癌细胞膜具有靶向同源肿瘤的能力，因此，研究者认为，间充质干细胞膜和癌细胞膜用于包覆纳米粒将赋予仿生纳米粒骨归巢和肿瘤靶向的双重靶向能力，可将仿生纳米粒精确地导航至肿瘤及肿瘤骨转移部位。细胞膜作为一种流动性良好的脂质双层膜，可用于包覆多种无机材料和有机材料，如硫辛酸纳米粒(LA-NP)或硫辛酸-细胞内化肽6聚合物(LACLss)或硫辛酸交联硫辛酸-细胞内化肽6纳米粒(LC)或硬脂酰多肽聚合物(SHRss)或聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米粒或二氧化硅、介孔二氧化硅纳米粒(MSN)或黑磷(P)或石墨烯量子点聚合物(GODss)或肽修饰的多壁碳纳米管(MHR)，以及金纳米粒，四氧化三铁纳米粒聚乳酸共聚物PLA，聚己内酯共聚物PCL，聚丙烯酰胺，脂质体，明胶等。基于现有技术的基础，本专利技术拟利用所述的纳米粒作为内核进行载药，并用所构建的基于间充质干细胞-癌细胞融合膜进行包覆，形成经典的核-壳结构；提供一种基于间充质干细胞的融合癌细胞膜仿生纳米粒，该仿生纳米载药系统可精准地靶向肿瘤及肿瘤骨转移部位，发挥增强的肿瘤杀伤作用，抑制肿瘤的骨转移。
技术实现思路
本专利技术的目的在于基于现有技术的基础，提供一种基于间充质干细胞的融合癌细胞膜仿生纳米粒，具体涉及构建一种基于间充质干细胞融合癌细胞膜的靶向肿瘤及骨转移性肿瘤的仿生纳米粒(简称TB@NP)及其制备方法与应用。本专利技术的仿生纳米粒为载药纳米粒，由一层融合细胞膜包覆，融合膜由间充质干细胞膜和癌细胞膜组成，制成可靶向肿瘤及肿瘤骨转移部位的仿生纳米递药系统。本专利技术以硫辛酸纳米粒(LA-NP)或硫辛酸-细胞内化肽6聚合物(LACLss)或硫辛酸交联硫辛酸-细胞内化肽6纳米粒(LC)或硬脂酰多肽聚合物(SHRss)或聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米粒或二氧化硅、介孔二氧化硅纳米粒(MSN)或黑磷(P)或石墨烯量子点聚合物(GODss)或肽修饰的多壁碳纳米管(MHR)为材料包载药物或模型药物，同时包覆间充质干细胞-癌细胞融合膜形成具有核-壳结构的仿生纳米递药系统。该仿生纳米系统一方面继承了间充质干细胞的骨归巢作用，另一方面继承了癌细胞膜的肿瘤同源靶向能力，能精确靶向肿瘤及肿瘤骨转移部位并释放药物发挥药效，抑制肿瘤的骨转移及其进展。本专利技术中，包载的药物可为小分子药物如多西他赛(DTX)，氯尼达明(LND)，阿霉素(Dox)等和基因药物如胞嘧啶-鸟嘌呤二脱氧核苷酸(CpG)，siRNAs，miRNAs等；可构建单药或多药递送系统，进一步增强抗肿瘤进展和骨转移的作用。本专利技术中，间充质干细胞来源种属为小鼠或大鼠，癌细胞来源种属为人或小鼠。本专利技术中，间充质干细胞可采用淋巴分离液、贴壁分离法、红细胞裂解法、流式分选法、免疫磁珠法及比重为1.073g/mL的percoll分层液密度梯度离心分离纯化获得，培养至第三代细胞纯度可达90％，可收集细胞至第六代。本专利技术中，细胞膜通过微型挤出器连续挤出或反复冻融法或超声破碎法破碎细胞，并通过低速离心(500-3000g离心5-20min)去除细胞内容物沉淀，上清再经高速离心(10000g及以上离心力至少离心30min)纯化获得细胞膜沉淀，所得细胞膜电位在-5至-30mV左右，每107细胞含细胞膜蛋白量为0.3-1.5mg左右。本专利技术中，利用细胞膜的生物流动性，间充质干细胞膜(Bm)和癌细胞膜(Tm)以超声的方式融合，具体方法为等膜蛋白量的间充质干细胞膜和癌细胞膜共孵育并于超声仪中超声融合5min，即得癌细胞-间充质干细胞融合膜(简称TBm)。本专利技术中，细胞膜的包覆可采用超声处理或微型挤出器连续挤出的方法。超声处理具体操作为：TBm与纳米粒以一定比例共孵育并于500W，10kHz的条件下超声5min，即得。微型挤出器连续挤出具体操作为：TBm与纳米粒以一定比例共孵育，并分别利用微型挤出器于400nm和200nm聚碳酸酯膜连续来回挤出20次，即得。再利用离心超滤的方法纯化，具体操作为：仿生纳米粒溶液于3000rpm，离心10min后收集上清再利用100kMWD的超滤管以3500rpm的转速离心10min进行纯化。本专利技术中，TBm包覆的仿生纳米粒(简称TB@NP)粒径在80-250nm之间，相对于未包覆的纳米粒粒径增加了5-30nm，电位则与细胞膜电位相当，在-5到-30mV之间。本专利技术主要采用人前列腺癌细胞系PC-3、C4-2B和人骨肉瘤细胞MG-63或小鼠成骨细胞癌细胞系MC3T3-E1共孵育的条件培养基模拟前列腺癌体外骨转移的微环境；PC-3、C4-2B是一种经典的人前列腺癌细胞，来源于前列腺癌患者的骨转移灶，而MG-63和MC3T3-E1分别为来自人和小鼠的成骨肉瘤细胞系，具有成骨细胞的特性，收集二者共孵育的条件培养基可模拟体外骨转移的微环境；其他癌系的体外骨转移模型也可以此法进行构建。本专利技术建立了肿瘤骨转移体内模型：将BALB/c裸小鼠的右后肢胫骨和股骨弯曲呈90°，沿胫骨长轴的方向将5×105-106个癌细胞注射进骨髓，肿瘤骨转移模型可在一周内形成。本专利技术分别构建了肿瘤骨转移的体内外模型，并对所制得的TB@NP仿生纳米递药系统的体内外靶向能力及药效进行了相关评价。本专利技术所制备的TB@NP仿生纳米递药系统通过尾静脉注射的方式给药。本专利技术制备的TB@NP仿生纳米递药系统通过尾静脉注射进入小鼠体内后，结果显示，能发挥肿瘤-骨主动靶向作用，精确靶向肿瘤骨转移部位，渗透进肿瘤细胞内释放药物，发挥抗肿瘤作用(如图1所示)。本专利技术的优点在于：本专利技术制得的TB@NP同时具有癌细胞膜的肿瘤同本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于间充质干细胞的融合癌细胞膜仿生纳米粒，其特征在于，所述的仿生纳米粒为载药纳米粒（简称TB@NP），由一层融合细胞膜包覆，融合膜由间充质干细胞膜和癌细胞膜组成，制成可靶向肿瘤及肿瘤骨转移部位的仿生纳米递药系统。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于间充质干细胞的融合癌细胞膜仿生纳米粒，其特征在于，所述的仿生纳米粒为载药纳米粒（简称TB@NP），由一层融合细胞膜包覆，融合膜由间充质干细胞膜和癌细胞膜组成，制成可靶向肿瘤及肿瘤骨转移部位的仿生纳米递药系统。


2.按权利要求1所述的基于间充质干细胞的融合癌细胞膜仿生纳米粒，其特征在于，所述的间充质干细胞提取自小鼠或大鼠的骨髓、胚胎或脐带，采用淋巴分离液、贴壁分离法、红细胞裂解法、流式分选法、免疫磁珠法及percoll分层液密度梯度离心分离纯化制得。


3.按权利要求1所述的基于间充质干细胞的融合癌细胞膜仿生纳米粒，其特征在于，所述的融合的癌细胞膜来源于任一种具有骨转移潜能的癌症，所述癌症选自前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌，肾癌，肺癌，肝癌，宫颈癌或直肠癌。


4.按权利要求1-3任一所述的基于间充质干细胞的融合癌细胞膜仿生纳米粒，其特征在于，所述的间充质干细胞膜和癌细胞膜通过下述方法制备：培养的间充质干细胞和癌细胞通过细胞刮收集，重悬于4℃预冷的pH7.4的TM缓冲液中，经挤出器挤出，超声后，离心去除细胞内容物，收集上清继续离心，得沉淀，用TM缓冲液洗并重悬，再离心，得细胞膜沉淀，-80℃冰箱备用。


5.按权利要求1所述的基于间充质干细胞的融合癌细胞膜仿生纳米粒，其特征在于，所述的纳米粒作为内核，其为无机纳米粒或有机纳米粒，选自硫辛酸纳米粒（LA-NP）或硫辛酸-细胞内化肽6聚合物（LACLss）或硫辛酸交联硫辛酸-细胞内化肽6纳米粒（LC）或硬脂酰多肽聚合物（SHRss）或聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒或二氧化硅、介孔二氧化硅纳米粒（MSN）或黑磷（P）或石墨烯量子点聚合物（GODss）或肽修饰的多壁碳纳米管（MHR）的任意一种。


6.按权利要求5所述的基于间充质干细胞的融合癌细胞膜仿生纳米粒的制备方法，其特征在于，其包括步骤：
（1）制备硫辛酸纳米粒LA-NP：硫辛酸（LA）与半胱氨酸（Cys）溶于甲醇，室温搅拌交联，氮气吹干甲醇，加二氯甲烷溶解，同时加入1%的胆酸钠溶液，超声乳化，加入双蒸水，搅拌离心后，用W超滤管离心，得到纯化的LA-NP；
（2）制备LACLss胶束：利用固相合成法合成LACL多肽,LACL与过量的半胱氨酸于甲醇中搅拌交联，氮气吹干甲醇，LACLss溶于双蒸水中，自组装形成LACLss胶束；
（3）制备LC纳米粒：将LA-NP与LACLss混合，共孵育自组装得LC纳米粒；
（4）制备硬脂酰多肽聚合物SHRss：利用固相合成法合成硬脂酰多肽；所述SHR用双蒸水配置成...

【专利技术属性】
技术研发人员：高原，陈继源，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31