一种杂化中性粒细胞机器人的制备方法技术

一种杂化中性粒细胞机器人的制备方法，它涉及微纳米机器人技术领域。本发明专利技术要构建同时具有生物质活性和合成材料功能的杂化中性粒细胞机器人。方法为：获取中性粒细胞；采用乳化蒸发联合纳米挤压法制备大肠杆菌外膜伪装的四氧化三铁磁性纳米粒子掺杂的载药纳米凝胶颗粒；将步骤一获得的中性粒细胞与步骤二的纳米凝胶颗粒共培养，诱导中性粒细胞吞噬纳米凝胶颗粒，得杂化中性粒细胞机器人。本发明专利技术杂化中性粒细胞机器人仍然是活细胞，可以在细胞因子、炎症因子、趋化肽等物质刺激下进行定向的趋化运动，具有良好的生物相容性，能够跨越血脑屏障，能避免免疫清除，在体内较好存活，具有较好的生物医学应用前景，本发明专利技术应用于医学领域。

【技术实现步骤摘要】
一种杂化中性粒细胞机器人的制备方法
本专利技术涉及微纳米机器人
，具体涉及一种杂化中性粒细胞机器人的制备方法。
技术介绍
中性粒细胞是体内最丰富的白细胞，是固有免疫的一部分，在固有免疫响应过程中最先被招募，起到消灭病原体、吞噬异物等功能。将来源于生物体的中性粒细胞与合成材料纳米粒子相结合，构建生物相容性好，不易被免疫清除的生物杂化机器人，能够在体内靶向药物递送、跨越特殊生物屏障等体内治疗场景中得到丰富的应用。但是目前多采用纳米磁性粒子制备得到纳米机器人，并在其表面附载药物位点或者标记物等，或者将DNA片段等与磁性粒子结合制备纳米机器人，并没有采用中性粒细胞与纳米磁性粒子结合的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了构建同时具有生物质活性和合成材料功能的杂化中性粒细胞机器人。而提供一种杂化中性粒细胞机器人的制备方法。本专利技术的一种杂化中性粒细胞机器人的制备方法，它是按照以下步骤进行的：步骤一、获取中性粒细胞；步骤二、采用乳化蒸发联合纳米挤压法制备大肠杆菌外膜伪装的四氧化三铁磁性纳米粒子掺杂的载药纳米凝胶颗粒；步骤三、将步骤一获得的中性粒细胞与步骤二的纳米凝胶颗粒共培养，诱导中性粒细胞吞噬纳米凝胶颗粒，制备得到杂化中性粒细胞机器人。进一步地，步骤一中所述的获取中性粒细胞是从新鲜分离的小鼠骨髓中分离获取的。进一步地，所述的中性粒细胞是通过如下方式获取：1)将小鼠后肢股骨、胫骨或前肢肱骨，剪断两端，以RPMI1640培养基冲洗骨内腔多次，直至骨呈白色半透明，收集RPMI1640培养基冲洗液，离心后，收取固相物并重悬于磷酸盐缓冲液中，得细胞悬液；2)依次将体积百分含量为71％Percoll分离液与体积百分含量为61％Percoll分离液加入离心管中，形成界面；所述的体积百分含量为71％Percoll分离液与体积百分含量为61％Percoll分离液是通过体积百分含量为100％Percoll分离液与生理盐水配制而成；3)向步骤2)中体积百分含量为61％Percoll分离液表面加入步骤1)的细胞悬液，离心后，吸取位于体积百分含量为71％Percoll分离液与体积百分含量为61％Percoll分离液界面液体，即得到中性粒细胞。进一步地，步骤1)中所述的离心是在1600rpm离心5min。进一步地，步骤3)中所述的离心是在3000rpm离心30min。进一步地，所述的体积百分含量为100％Percoll分离液是采用Percoll原液与浓度为1.5MNaCl溶液按体积比为9:1的比例混合而成。进一步地，步骤二中所述的载药纳米凝胶颗粒具体制备方法如下：1)按质量体积比为1～1.5g：20mL的比例将明胶与水混合，再加入浓度为0.1mol/LNaOH溶液，在70℃条件下搅拌30min后，加入己酸酐，在70℃条件下反应5h；所述的NaOH溶液与明胶的体积质量比为2mL:1～1.5g；己酸酐与明胶的体积质量比为4mL:1～1.5g；2)步骤1)反应后降至室温，调节pH至7.4，使用体积百分含量为25％乙醇透析24h后，将透析液在60℃烘箱中烘干，得两亲明胶；3)使用氯仿分散紫杉醇和直径为6nm的四氧化三铁纳米粒子，得有机相；用水溶解步骤2)的两亲明胶，得水相；将有机相加入水相，超声清洗20min，在50℃的条件下搅拌去除有机溶剂，得到纳米凝胶颗粒，离心清洗3次，置于4℃条件下备用；其中，氯仿与四氧化三铁纳米粒子和紫杉醇的质量体积比为0.2～0.5mL：2～3mg：1mg；4)将培养后的大肠杆菌，5000rpm离心10min去除菌体，过0.45微米滤膜，使用超滤离心管浓缩上清液，在4℃条件下150000rpm离心2h，得到大肠杆菌外膜囊泡；5)使用纳米挤压法，将大肠杆菌外膜囊泡通过200nm滤膜挤压11次，获得细菌膜囊泡；6)将步骤5)得到的细菌膜囊泡与步骤3)得到的纳米凝胶颗粒混合，通过200nm滤膜挤压21次，离心清洗3次，得载药纳米凝胶颗粒。进一步地，所述的离心清洗转速均为10000rpm。进一步地，超滤离心管的截留分子量为100kDa。进一步地，步骤三中所述的将步骤一获得的中性粒细胞与步骤二的纳米凝胶颗粒共培养，是通过如下方式进行的：将步骤一得到的中性粒细胞用PBS稀释，然后离心去除分离中性粒细胞的所用的Percoll分离液；然后将步骤二的纳米凝胶颗粒分散到去除Percoll分离液的中性粒细胞悬液中，在37℃水浴条件下共培养30min后，离心清洗，即完成所述的共培养。本专利技术中杂化中性粒细胞机器人的运动原理是：一、杂化中性粒细胞机器人内部携带四氧化三铁磁性纳米粒子，因此杂化中性粒细胞机器人可以在交变磁场的作用下进行旋转运动；二、中性粒细胞对炎症因子的浓度梯度有响应，可以构建炎症因子的浓度梯度，诱导杂化中性粒细胞机器人进行趋化运动。本专利技术细菌膜伪装凝胶颗粒具有装载药物，装载荧光探针等功能，在应用中可以进行药物释放，荧光成像等功能。细菌膜表面分子可以与中性粒细胞表面受体相作用，细菌膜伪装提高了中性粒细胞对凝胶颗粒的吞噬速度，可快速制备得到杂化中性粒细胞机器人，同时细菌膜伪装可以减缓药物释放，降低装载药物在杂化中性粒细胞机器人内部的泄露。本专利技术包含以下有益效果：本专利技术制备得到的杂化中性粒细胞机器人由于其内部装载有磁性凝胶颗粒，可以由磁场(>6mT)进行驱动，并且杂化中性粒细胞机器人仍然是活细胞，可以在细胞因子、炎症因子、趋化肽等物质刺激下进行定向的趋化运动。本专利技术充分利用中性粒细胞的吞噬能力及运动能力，制备得到具有细胞活性和磁性响应的双响应杂化中性粒细胞机器人，制备过程安全、高效、快速，在18mT强度的旋转磁场下，杂化中性粒细胞马达可以达到>14μm/s的运动速度，在趋化条件下，可以达到约0.2μms-1的运动速度，并且具有良好的生物相容性，能够跨越血脑屏障，能避免免疫清除，在体内较好存活，具有较好的生物医学应用前景。本专利技术的杂化中性粒细胞机器人具有装载药物，装载荧光探针的功能，具有不易被免疫系统清除的功效，能够在体内靶向药物递送、跨越特殊生物屏障等体内治疗场景中得到丰富的应用。附图说明图1为杂化中性粒细胞机器人的光学显微镜照片，标尺为20μm；图2为杂化中性粒细胞机器人在交变磁场中运动的光学显微镜照片，标尺为10μm；图3为杂化中性粒细胞机器人在趋化因子浓度梯度中运动的光学显微镜照片，标尺为10μm。图4为杂化中性粒细胞机器人的钙黄绿素乙酰氧基甲酯-碘化丙啶联合染色的荧光显微镜照片，标尺为200μm；图5为杂化中性粒细胞机器人的显微镜荧光照片，(A)为DiI荧光通道，(B)为香豆素-6荧光通道，(C)为叠加通道，标尺为20μm。具体实施方式本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本专利技术的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杂化中性粒细胞机器人的制备方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：/n步骤一、获取中性粒细胞；/n步骤二、采用乳化蒸发联合纳米挤压法制备大肠杆菌外膜伪装的四氧化三铁磁性纳米粒子掺杂的载药纳米凝胶颗粒；/n步骤三、将步骤一获得的中性粒细胞与步骤二的纳米凝胶颗粒共培养，诱导中性粒细胞吞噬纳米凝胶颗粒，制备得到杂化中性粒细胞机器人。/n

【技术特征摘要】
1.一种杂化中性粒细胞机器人的制备方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：
步骤一、获取中性粒细胞；
步骤二、采用乳化蒸发联合纳米挤压法制备大肠杆菌外膜伪装的四氧化三铁磁性纳米粒子掺杂的载药纳米凝胶颗粒；
步骤三、将步骤一获得的中性粒细胞与步骤二的纳米凝胶颗粒共培养，诱导中性粒细胞吞噬纳米凝胶颗粒，制备得到杂化中性粒细胞机器人。


2.根据权利要求1所述的一种杂化中性粒细胞机器人的制备方法，其特征在于步骤一中所述的获取中性粒细胞是从新鲜分离的小鼠骨髓中分离获取的。


3.根据权利要求1或2所述的一种杂化中性粒细胞机器人的制备方法，其特征在于所述的中性粒细胞是通过如下方式获取：
1)将小鼠后肢股骨、胫骨或前肢肱骨，剪断两端，以RPMI1640培养基冲洗骨内腔多次，直至骨呈白色半透明，收集RPMI1640培养基冲洗液，离心后，收取固相物并重悬于磷酸盐缓冲液中，得细胞悬液；
2)依次将体积百分含量为71％Percoll分离液与体积百分含量为61％Percoll分离液加入离心管中，形成界面；所述的体积百分含量为71％Percoll分离液与体积百分含量为61％Percoll分离液是通过体积百分含量为100％Percoll分离液与生理盐水配制而成；
3)向步骤2)中体积百分含量为61％Percoll分离液表面加入步骤1)的细胞悬液，离心后，吸取位于体积百分含量为71％Percoll分离液与体积百分含量为61％Percoll分离液界面液体，即得到中性粒细胞。


4.根据权利要求3所述的一种杂化中性粒细胞机器人的制备方法，其特征在于步骤1)中所述的离心是在1600rpm离心5min。


5.根据权利要求3所述的一种杂化中性粒细胞机器人的制备方法，其特征在于步骤3)中所述的离心是在3000rpm离心30min。


6.根据权利要求3所述的一种杂化中性粒细胞机器人的制备方法，其特征在于所述的体积百分含量为100％Percoll分离液是采用Percoll原液与浓度为1.5MNaCl溶液按体积比为9:1的比例混合而成。


7.根据权利要求1所述的一种杂化中性粒细胞机...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴志光，张红玥，贺强，李泽生，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23