三维培养肺及肺癌组织类器官的标准化培养基及培养方法技术

本发明专利技术公开了一种三维培养肺及肺癌组织类器官的标准化培养基及培养方法，包括试剂A和试剂B中的至少一种或多种；试剂A包含R‑spondin1、Noggin、N‑乙酰半胱氨酸、烟酰胺、Y‑27632、A8301、SB202190、FGF‑7和FGF‑10中的一种或多种；试剂B包含试剂B1、试剂B2和试剂B3；试剂B1包含牛垂体蛋白质抽提液、Y‑27632、DAPT、氢化可的松、胰岛素、庆大霉素、两性霉素、维A酸、转铁蛋白、甲碘安、肾上腺素和人表皮生长因子中的一种或多种；试剂B2包含肝素；试剂B3包含DMEM/F12、L‑ascorbic acid‑2‑phosphate magnesium和sodium selenium中的一种或多种。本发明专利技术针对于肺组织中成体干细胞的生长特点，选用了多种生长因子成份进行调和，经过优化培养基中生长因子的配比，正常的肺组织及肺癌细胞能够有效地在三维培养环境中形成肺和肺癌的类器官。

【技术实现步骤摘要】
三维培养肺及肺癌组织类器官的标准化培养基及培养方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种三维培养肺及肺癌组织类器官的标准化培养基及培养方法。
技术介绍
类器官技术是近些年生物学领域一项重大的突破。通过类器官培养技术，科学家们建立起了全新的体外培养的模型，用来培养正常或者病变癌组织。正常类器官可以模拟正常组织的形态，结构和功能性特征；癌的类器官表现出在体癌肿的形态学特点，基因突变谱和表型特点。正常及癌类器官可以在体外长期稳定的培养，所以类器官培养技术可以将大部分活体的生物学过程在培养皿中进行，这一革命性的技术进步为癌症及人体生物学的研究建立一个全新的平台，肿瘤类器官更是为肿瘤患者的个性化治疗提供巨大的帮助。目前科学家们已经成功建立了人体主要器官及其肿瘤的类器官培养体系。然而，作为一项新兴的技术，很多器官的类器官三维培养缺少标准化的培养基。尽管已有报道在不同三维培养条件下，可以成功培养出肺和肺癌的类器官。但是，到目前为止，还没有一种标准化的培养基。这种现状制约了肺和肺癌类器官的在研究和临床治疗中的广泛的应用。
技术实现思路
为了解决肺/肺癌组织体外类器官培养过程中缺少标准化培养基的问题，本专利技术的目的在于提供一种三维培养肺及肺癌组织类器官的标准化培养基及培养方法，本专利技术的培养基针对于肺组织中成体干细胞的生长特点，选用了多种生长因子成份进行调和，经过优化培养基中生长因子的配比，正常的肺组织及肺癌细胞能够有效地在三维培养环境中形成肺和肺癌的类器官。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种三维培养肺及肺癌组织类器官的标准化培养基，包括试剂A和试剂B中的至少一种或多种；试剂A包含R-spondin1、Noggin、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、Y-27632、A8301、SB202190、FGF-7和FGF-10中的一种或多种；试剂B包含试剂B1、试剂B2和试剂B3；试剂B1包含牛垂体蛋白质抽提液、Y-27632、DAPT、氢化可的松、胰岛素、庆大霉素、两性霉素、维A酸、转铁蛋白、甲碘安、肾上腺素和人表皮生长因子中的一种或多种；试剂B2包含肝素；试剂B3包含DMEM/F12、L-ascorbicacid-2-phosphatemagnesium和sodiumselenium中的一种或多种。优选地，在试剂A中，以标准化培养基的终体积为基准来计算，R-spondin1的浓度为10%，Noggin的浓度为10%，N-乙酰半胱氨酸的浓度为0.125~12.5mM，烟酰胺的浓度为1~100mM，Y-2763的浓度为2.5~250uM，A8301的浓度为50~5000nM，SB202190的浓度为0.1~100uM，FGF-7的浓度为0.5~50ng/ml，FGF-10的浓度为l2~120ng/ml。优选地，在试剂B1中，以标准化培养基的终体积为基准来计算，BovinePituitaryExtract(BPE)的浓度为5~500ug/ml，Y-27632的浓度为1~100uM，DAPT的浓度为1~100uM，氢化可的松的浓度为0.1~10uM，胰岛素的浓度为1~100ug/ml，庆大霉素的浓度为3~300mg/ml，两性霉素的浓度为1.5~150ng/ml，维A酸的浓度为10~1000nM，转铁蛋白的浓度为0.5~50mg/ml，甲碘安的浓度为1~100nM，肾上腺素的浓度为10~1000nM，人表皮生长因子的浓度为5~500ng/ml。优选地，在试剂B2中，以标准化培养基的终体积为基准来计算，肝素的浓度为0.4~40ug/ml。优选地，所述标准化培养基还可以包括Primocin。优选地，以标准化培养基的终体积为基准来计算，所述Primocin的浓度为100ug/ml。优选地，所述标准化培养基还可以包括Heregulinbeta-1或Nutlin-3a。优选地，以标准化培养基的终体积为基准来计算，Heregulinbeta-1的浓度为0.5~50nM。优选地，以标准化培养基的终体积为基准来计算，Nutlin-3a的浓度为0.5~50uM。优选地，所述标准化培养基用于建立肺类器官时，所述标准化培养基包括基础培养基、试剂A、B27、Primocin和Heregulinbeta-1。优选地，所述标准化培养基用于扩增肺类器官时，所述标准化培养基包括基础培养基、试剂A、B27和Primocin。优选地，所述标准化培养基用于诱导分化气道类器官时，所述标准化培养基包括试剂B和Primocin。优选地，所述标准化培养基用于建立肺癌类器官时，所述标准化培养基包括基础培养基、试剂A、B27和Primocin。优选地，所述标准化培养基用于扩增肺癌类器官时，所述标准化培养基包括基础培养基、试剂A、B27、Primocin和Nutlin-3a。优选地，所述基础培养基以AdvancedF12/DMEM为溶剂，并包含以下成分：N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、青霉素及链霉素。优选地，在基础培养基中，以基础培养基的终体积为基准计算，N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸的浓度为10~1000mM，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的浓度为20~2000mM，青霉素的浓度为10000U/ml，链霉素的浓度为10000ug/ml。优选地，以标准化培养基的终体积为基准来计算，B27的浓度为2%。优选地，以标准化培养基的终体积为基准来计算，Primocin的浓度为100ug/ml。优选地，所述B27以神经干细胞培养基为溶剂，并以B27的终体积为基准计算包含以下成分：过氧化氢酶12.5~1250μg/ml谷胱甘肽（还原型）5~500μg/ml人胰岛素15.6~1560μg/ml超氧化物歧化酶37.5~3750U/ml人转铁蛋白25~2500μg/mlT3(triodo-I-thyronine)0.01~1μg/ml露卡西左旋肉碱10~1000μg/ml乙醇胺0.1~10mg/mlD-(+)-吡喃葡萄糖75~7500μg/ml腐胺80.5~8050μg/ml亚硒酸钠62.5~6250μg/ml皮质酮0.1~10μg/ml亚油酸5~500μg/ml加莫尼克酸5~500μg/ml黄体酮31.5~3150μg/ml维生素A醋酸酯0.5~50μg/ml维它命E油5~500μg/mlDL-α-生育酚乙酸酯5~500μg/ml生物素12.5~1250μg/ml牛血清白蛋白12.5%。本专利技术还提供一种三维培养肺及肺癌组织类器官的标准化培养方法，包括：（1）建立肺类器官：采用建立肺类器官培养基作为标准化培养基，所述建立肺类器官培养基包括基础培养基、试剂A、B27、Primocin和Heregulinbet本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三维培养肺及肺癌组织类器官的标准化培养基，其特征在于：包括试剂A和试剂B中的至少一种或多种；/n试剂A包含R-spondin1、Noggin、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、Y-27632、A8301、SB202190、FGF-7和FGF-10中的一种或多种；/n试剂B包含试剂B1、试剂B2和试剂B3；/n试剂B1包含牛垂体蛋白质抽提液、Y-27632、DAPT、氢化可的松、胰岛素、庆大霉素、两性霉素、维A酸、转铁蛋白、甲碘安、肾上腺素和人表皮生长因子中的一种或多种；/n试剂B2包含肝素；/n试剂B3包含DMEM/F12、L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium和sodium selenium中的一种或多种。/n

【技术特征摘要】
1.一种三维培养肺及肺癌组织类器官的标准化培养基，其特征在于：包括试剂A和试剂B中的至少一种或多种；
试剂A包含R-spondin1、Noggin、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、Y-27632、A8301、SB202190、FGF-7和FGF-10中的一种或多种；
试剂B包含试剂B1、试剂B2和试剂B3；
试剂B1包含牛垂体蛋白质抽提液、Y-27632、DAPT、氢化可的松、胰岛素、庆大霉素、两性霉素、维A酸、转铁蛋白、甲碘安、肾上腺素和人表皮生长因子中的一种或多种；
试剂B2包含肝素；
试剂B3包含DMEM/F12、L-ascorbicacid-2-phosphatemagnesium和sodiumselenium中的一种或多种。


2.根据权利要求1所述的三维培养肺及肺癌组织类器官的标准化培养基，其特征在于：
在试剂A中，以标准化培养基的终体积为基准来计算，R-spondin1的浓度为10%，Noggin的浓度为10%，N-乙酰半胱氨酸的浓度为0.125~12.5mM，烟酰胺的浓度为1~100mM，Y-2763的浓度为2.5~250uM，A8301的浓度为50~5000nM，SB202190的浓度为0.1~100uM，FGF-7的浓度为0.5~50ng/ml，FGF-10的浓度为l2~1200ng/ml；
在试剂B1中，以标准化培养基的终体积为基准来计算，BovinePituitaryExtract(BPE)的浓度为5~500ug/ml，Y-27632的浓度为1~100uM，DAPT的浓度为1~100uM，氢化可的松的浓度为0.1~10uM，胰岛素的浓度为1~100ug/ml，庆大霉素的浓度为3~300mg/ml，两性霉素的浓度为1.5~150ng/ml，维A酸的浓度为10~1000nM，转铁蛋白的浓度为0.5~50mg/ml，甲碘安的浓度为1~100nM，肾上腺素的浓度为10~1000nM，人表皮生长因子的浓度为5~500ng/ml；
在试剂B2中，以标准化培养基的终体积为基准来计算，肝素的浓度为0.4~40ug/ml。


3.根据权利要求1所述的三维培养肺及肺癌组织类器官的标准化培养基，其特征在于：所述标准化培养基还包括Primocin，以标准化培养基的终体积为基准来计算，所述Primocin的浓度为100ug/ml。


4.根据权利要求1或3所述的三维培养肺及肺癌组织类器官的标准化培养基，其特征在于：所述标准化培养基还包括Heregulinbeta-1或Nutlin-3a，以标准化培养基的终体积为基准来计算，Heregulinbeta-1的浓度为0.5~50nM，Nutlin-3a的浓度为0.5~50uM。


5.根据权利要求1所述的三维培养肺及肺癌组织类器官的标准化培养基，其特征在于：
所述标准化培养基用于建立肺类器官时，所述标准化培养基包括基础培养基、试剂A、B27、Primocin和Heregulinbeta-1；
所述标准化培养基用于扩增肺类器官时，所述标准化培养基包括基础培养基、试剂A、B27和Primocin；
所述标准化培养基用于诱导分化气道类器官时，所述标准化培养基包括试剂B和Primocin；
所述标准化培养基用于建立肺癌类器官时，所述标准化培养基包括基础培养基、试剂A、B27和Primocin；
所述标准化培养基用于扩增肺癌类器官时，所述标准化培养基包括基础培养基、试剂A、B27、Primocin和Nutlin-3a。


6.根据权利要求5所述的三维培养肺及肺癌组织类器官的标准化培养基，其特征在于：所述基础培养基以AdvancedF12/DMEM为溶剂，并包含以下成分：N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸、...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑小佳，刘晓娟，王佳佳，
申请(专利权)人：海西纺织新材料工业技术晋江研究院，李羽舟，
类型：发明
国别省市：福建;35