一种脂蛋白(a)检测试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体涉及一种脂蛋白(a)检测试剂盒。本发明专利技术提供的脂蛋白(a)检测试剂盒主要由抗体酶标板、生物素抗体包被板、辣根过氧化物酶‑链亲和素、脂蛋白(a)系列标准品、稀释液、洗涤液、底物液、显色液和终止液组成。本发明专利技术提供的脂蛋白(a)检测试剂盒具有操作简单，灵敏度高和抗干扰能力强的优点，可以有效降低血清中其他物质的干扰，尤其是抗RF因子对检测结果的干扰作用，大大的提高检测结果准确性和稳定性。同时，该试剂盒还可以降低因脂蛋白(a)中载脂蛋白(a)分子KringleIV‑2拷贝数的差异性而导致的检测结果不准确的现象，更有利于动脉硬化和心脏疾病患者的早期诊断和预后处理。

【技术实现步骤摘要】
一种脂蛋白(a)检测试剂盒
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种脂蛋白(a)检测试剂盒。
技术介绍
脂蛋白(a)[Lipoprotein(a),Lp(a)]是人体内一种独特的脂蛋白，有低密度脂蛋白(LDL)样微粒和载脂蛋白(a)[Apolipoprotein(a),apo(a)]组成。目前，大量的流行病学和临床研究已经证明Lp(a)水平与心脏疾病和缺血性脑卒中存在连续的独立的中等程度的相关，虽然Lp(a)在不同人群的血液中存在较大的差异性，但其在同一个体血清中浓度相对稳定，除遗传因素外，几乎不受年龄、性别、吸烟、饮食、脂代谢、药物、环境等因素的影响。因此，高Lp(a)可以作为心脑血管动脉粥样硬化性疾病的独立危险因素。目前，Lp(a)的检测方法有：放射免疫法、ELISA法、免疫比浊法和脂蛋白(a)-胆固醇法等，各个检测方法均存在各自的优缺点。其中放射免疫法存在放射性污染，酶联免疫法受人为因素影响较大；脂蛋白(a)-胆固醇法操作复杂，需要用超速离心或其它方法从血浆中分离出脂蛋白(a)，然后再用胆固醇酶法检测脂蛋白(a)；免疫比浊法对不同大小的apo(a)分子检测偏差较大，与纤溶酶原有交叉反应，易受类风湿因子干扰。因此，研究和开发一种操作检测，检测结果准确度高和稳定性好的脂蛋白(a)检测试剂盒仍是当前亟需攻克的难题。ELISA法具有快速、灵敏度高和特异性强的优点，其用于脂蛋白(a)的检测中具有特度的优势。专利文献CN107037217A公开了一种脂蛋白a的酶联免疫试剂盒及其制备方法，所述脂蛋白a的酶联免疫检测试剂盒主要由(1)包被有抗脂蛋白a抗体的酶标板；(2)脂蛋白a系列标准品；(3)酶标记抗体溶液；(4)稀释液；(5)洗涤液；(6)底物液；(7)显色液；(8)终止液组成。所述酶标记抗体溶液为含5mg/L的HRP标记的抗脂蛋白a抗体、0.5mg/L的甘油单蓖麻油酸酯和0.5mg/L的BSA的50mmol/LPBS缓冲液，pH值为8.0，制备得到的试剂盒具有检测灵敏度高和稳定性好的优点。然而，本专利技术人在研究中发现，但是该检测试剂盒在检测过程中易于受到由可能存在于测试样品中的嗜异性抗体引起的干扰，尤其是类风湿因子(rheumatoidfactor，RF)引起的干扰。类风湿因子是在类风湿性关节炎(RA)病人血清中发现，是一种以变性IgG为靶抗原的自身抗体，主要存在于类风湿性关节炎患者的血清和关节液中，它是一种抗变性IgG的抗体，属IgM型，可与IgGFc段结合。因此，可能会导致检测结果差异性较大，准确性较低，不适合广泛推广和应用。
技术实现思路
为了解决现有技术中脂蛋白(a)的酶联免疫试剂盒的不足，本专利技术目的在于提供一种脂蛋白(a)检测试剂盒，该检测试剂盒具有灵敏度高、抗干扰能力强，检测准确度和稳定性好的优点。本专利技术提供了一种脂蛋白(a)检测试剂盒，包括抗体酶标板、生物素抗体包被板、辣根过氧化物酶-链亲和素、脂蛋白(a)系列标准品、稀释液、洗涤液、底物液、显色液和终止液；所述酶标板抗体包括包被在酶标板上的抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体；所述生物素抗体包被板包括包被在微孔板的生物素标记的抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体。进一步地，所述抗体酶标板的制备方法为：用pH为8.0的0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液将抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体稀释至10～20μg/ml，按100μl/孔的加入量加于96孔酶标板中，在温度为4℃的条件下放置过夜，倾去包被液，加入封闭液进行封闭，所述封闭液由0.2％BSA和3～6g/L乙基苯基聚乙二醇混合组成，真空干燥，密封，即得。进一步地，所述生物素抗体包被板的制备方法为：将抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体与活化的生物素混合进行标记，透析去除未结合的生物素，得生物素抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体；用pH为9.5的碳酸钠缓冲液将抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体稀释至10～20μg/ml，按100μl/孔的加入量加于微孔板中，在温度为4℃的条件下放置过夜，倾去包被液，加入封闭液进行封闭，所述封闭液由0.2％BSA和3～6g/L乙基苯基聚乙二醇混合组成，真空干燥，密封，即得。进一步地，所述抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体为羊抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体。进一步地，所述脂蛋白(a)系列标准品的脂蛋白(a)含量为：0、10、50、100、200、400和600mg/L的50mmol/LPBS缓冲液。进一步地，所述稀释液由以下组分组成：乙基苯基聚乙二醇10～15g/L、月桂醇聚氧乙烯醚5～8g/L、精氨酸12～15g/L、丙酮酸钠2～4g/L、氯化钠6～8g/L、余量为pH为7.4的0.05mol/L碳酸钠缓冲液。进一步地，所述稀释液由以下组分组成：乙基苯基聚乙二醇12g/L、月桂醇聚氧乙烯醚6g/L、精氨酸13g/L、丙酮酸钠3g/L、氯化钠6g/L、余量为pH为7.4的0.05mol/L碳酸钠缓冲液。进一步地，所述洗涤液由以下组分组成：乙基苯基聚乙二醇8～12g/L、月桂醇聚氧乙烯醚3～6g/L、余量为pH为7.2的0.01mol/L碳酸钠缓冲液。进一步地，所述底物液为pH为7.4的0.05mol/L碳酸钠缓冲液配制的5％过氧化氢溶液。进一步地，所述显色液为浓度为0.5mg/ml的四甲基联苯胺的甲醇溶液，所述述终止液为浓度为3mol/L硫酸。目前，ELISA法虽具有快速、灵敏度高和特异性强的优点，但是其灵敏度会随着标记的酶的活性而存在差异，且会随着酶活性的降低而降低，而且对于脂蛋白(a)检测会存在嗜异性抗体引起的干扰，尤其是类风湿因子引起的干扰，同时还会存在胆红素、血红蛋白和三酰甘油等干扰物质的影响，导致试剂盒的检测结果准确度低，严重影响病程的判断。为了解决上述问题，本专利技术人提供了一种专用的抗干扰稀释液和洗涤液，可以避免或减轻血清尤其是血清中除了脂蛋白(a)之外的其他物质对脂蛋白(a)检测结果干扰的现象，尤其是可以消除RF因子对测定结果的干扰，还可以消除一定量的胆红素、血红蛋白和三酰甘油等干扰物质对检测结果的干扰，从而提高检测结果的准确性。本专利技术提供的脂蛋白(a)检测试剂盒是本专利技术人经过大量的摸索试验验证得到的。乙基苯基聚乙二醇是一种非离子性非变性去垢剂和表面活性剂，专利技术人在试验中意外发现，乙基苯基聚乙二醇可以降低样品中RF因子与抗人IgG结合的能力，而标记抗体与待测抗原的结合能力不受影响，同时，其还可以降低一定量的胆红素、血红蛋白和三酰甘油等干扰物质对检测结果的影响，从而达到抗干扰的效果。其抗干扰原理专利技术人推测可能是：乙基苯基聚乙二醇可以打开抗变性IgG抗体中存在的二硫键，破坏抗变性IgG抗体的结构，从而消除抗变性IgG抗体的干扰作用。而且该乙基苯基聚乙二醇还可以降低一定量的胆红素、血红蛋白和三酰甘油等干扰物质对检测结果的影响，并且乙基苯基聚乙二醇的加入不影响标记抗体与待测抗原的结合能力，即对检测结果不会造成任何影响。进一步地，月桂醇聚氧乙烯醚是一种能与各本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，包括抗体酶标板、生物素抗体包被板、辣根过氧化物酶-链亲和素、脂蛋白(a)系列标准品、稀释液、洗涤液、底物液、显色液和终止液；所述酶标板抗体包括包被在酶标板上的抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体；所述生物素抗体包被板包括包被在微孔板的生物素标记的抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，包括抗体酶标板、生物素抗体包被板、辣根过氧化物酶-链亲和素、脂蛋白(a)系列标准品、稀释液、洗涤液、底物液、显色液和终止液；所述酶标板抗体包括包被在酶标板上的抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体；所述生物素抗体包被板包括包被在微孔板的生物素标记的抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体。


2.如权利要求1所述的脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，所述抗体酶标板的制备方法为：
用pH为8.0的0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液将抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体稀释至10～20μg/ml，按100μl/孔的加入量加于96孔酶标板中，在温度为4℃的条件下放置过夜，倾去包被液，加入封闭液进行封闭，所述封闭液由0.2％BSA和3～6g/L乙基苯基聚乙二醇混合组成，真空干燥，密封，即得。


3.如权利要求1所述的脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，所述生物素抗体包被板的制备方法为：
将抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体与活化的生物素混合进行标记，透析去除未结合的生物素，得生物素抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体；用pH为9.5的碳酸钠缓冲液将抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体稀释至10～20μg/ml，按100μl/孔的加入量加于微孔板中，在温度为4℃的条件下放置过夜，倾去包被液，加入封闭液进行封闭，所述封闭液由0.2％BSA和3～6g/L乙基苯基聚乙二醇混合组成，真空干燥，密封，即得。


4.如权利要求1～3任一所述的脂蛋白(a)检测试剂盒，其特征在于，所述抗人载脂蛋白(a)多克隆抗体为羊抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄秀珍，
申请(专利权)人：广州市奥宇科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44