基于新型冠状病毒抗原的乳胶微球免疫层析试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于新型冠状病毒抗原的乳胶微球免疫层析试纸条及其制备方法，试纸条包括PVC底板，所述PVC底板上从左到右依次搭接样品垫、乳胶微球垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸；所述乳胶微球垫上包被有乳胶微球标记的重组鼠抗人新型冠状病毒第一抗体；所述硝酸纤维素膜上包被有重组鼠抗人新型冠状病毒第二抗体作为检测线，以及包被有重组羊抗鼠新型冠状病毒抗体作为质控线。本发明专利技术乳胶微球免疫层析试纸条采用双抗体夹心免疫法检测新型冠状病毒，具有较好的敏感性、特异性、重复性和稳定性，对目标化合物的回收率较高，检验结果准确可靠；实现了新型冠状病毒的单人份快速定性检测，且灵敏度高，批内、批间差异小，为临床使用提供了极大便利。

【技术实现步骤摘要】
基于新型冠状病毒抗原的乳胶微球免疫层析试纸条及其制备方法
本专利技术涉及一种多样本的快速定性检测试纸条及制备方法，尤其是利用免疫乳胶微球层析技术测定血液、血清、唾液、粪便等多样本中新型冠状病毒抗原的快速定性检测试纸条及其制备方法。
技术介绍
目前COVID-19的检测方法主要是针对鼻咽部分泌物或采集血液进行病毒核酸RT-PCR检测为主，肺部X光为辅，但由于病毒RNA容易降解，测定结果易受样品采集和处理的影响。此外，虽然核酸检测方法敏感度较高，但要求生物安全II级实验室以及需昂贵的实验设备和专业的技术人员，由于检测能力的限制导致目前新型冠状病毒疑似病例远远高于确诊病例；同时，导致偏远地区的疑似样本必须送到专门的实验室进行核酸检测，运输过程中温度等不可控因素降低了样本的质量易造成假阴性，且运输距离和时间的增长也增加了病毒传播的可能性。除了核酸检测，还有对新型冠状病毒IgM/IgG抗体血清学的检测，该方法操作简便，快速，无需仪器设备，适合现场筛查。但是由于个体差异导致体内IgG/IgM浓度不尽相同，造成检测抗体血清学试验作为早期诊断方法容易出现假阴性。因此，建立一种克服体内早期抗体不足，且检测时间短、操作简单、灵敏度高、特异性高以及易于大规模推广的COVID-19测定方法，对患者提供早期、准确的实验室诊断是可行而必要的。
技术实现思路
为了解决新型冠状病毒大量的检测需求，本专利技术提供一种基于新型冠状病毒抗原的乳胶微球免疫层析试纸条及其制备方法，本专利技术是申请人对其在先申请，2020106817702检测新型冠状病毒的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法的进一步改进，试纸条采用乳胶微球，双抗体夹心免疫法制备。乳胶微球灵敏度比胶体金更高，因此最低检测线也更低。同时乳胶微球属于化学键的连接，也更加的稳定。同时，针对新型冠状病毒抗原的检测不同于之前的申请，抗原不仅只存在于人体血液中，还可能存活于空气、食品、粪便中，可以有效扩大检测范围。实现本专利技术目的的技术方案是：第一方面，本专利技术提供一种基于新型冠状病毒抗原的乳胶微球免疫层析试纸条，包括PVC底板，所述PVC底板上从左到右依次搭接样品垫、乳胶微球垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸；所述乳胶微球垫上包被有乳胶微球标记的重组鼠抗人新型冠状病毒第一抗体；所述硝酸纤维素膜上包被有重组鼠抗人新型冠状病毒第二抗体作为检测线，以及包被有重组羊抗鼠新型冠状病毒抗体作为质控线。所述乳胶微球标记的重组鼠抗人新型冠状病毒第一抗体的浓度为3-18μg/mL，其在乳胶微球垫上的包被量为200uL；所述重组鼠抗人新型冠状病毒第二抗体的浓度为0.5-3mg/ml，包被量为30uL；所述重组羊抗鼠新型冠状病毒抗体的浓度为0.5-3mg/ml，包被量为30uL。所述乳胶微球垫上还包括分离剂，所述分离剂为酪蛋白、BSA或PEG6000(聚乙二醇6000)中的任意一种或至少两种的组合，优选为浓度10％的PEG6000。专利技术人发现在乳胶微球垫上加入分离剂，使得重组鼠抗人新型冠状病毒第一抗体与乳胶微球颗粒的结合更加稳定，进一步降低了乳胶微球免疫层析试纸条的检测限，不仅如此，相比于BSA和酪蛋白，采用所述PEG6000作为分离剂时，乳胶微球标记物的复溶性和检测性能会进一步提升。所述乳胶微球垫上的乳胶微球颗粒的粒径为300-400nm。所述检测线的距离为3-5cm，检测线与质控线的距离为3-5cm，检测线和质控线相互不受干扰。所述样品垫为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜；所述乳胶微球垫为玻璃纤维膜。本专利技术中，所述乳胶微球免疫层析试纸条采用双抗体夹心免疫法，若检测样本为阳性，其中的样本中的新型冠状病毒抗原与乳胶微球标记的重组鼠抗人新型冠状病毒第一抗体结合形成复合物，在层析作用下复合物沿纸条向前移动，经过检测线时与预包被的重组鼠抗人新型冠状病毒第二抗体反应，形成免疫复合物而呈现红色条带，游离乳胶微球标记重组鼠抗人新型冠状病毒第一抗体则在质控线与重组羊抗鼠新型冠状病毒抗体结合显现红色条带；若检测样本为阴性，其中样本中不含有新型冠状病毒抗原，不会形成免疫复合物，在检测线处不会出现条带，仅在质控线显色；质控线在检测阳性样本和阴性样本时均应出现条带，所显现的红色条带是判定层析过程是否是正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。本专利技术，硝酸纤维素膜上包被的病毒抗体为鼠源性抗体，所述作为质控线的抗体为羊抗鼠抗体。鼠源性抗体是目前商业化抗体中最常见的抗体形式，来源广泛，成本较低，并且特异性和稳定性好。所述病毒抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，制备所述多克隆抗体或单克隆抗体的方法是本领域技术人员公知的，比如可以用相应病毒免疫动物，如鼠，从动物血清中纯化多克隆抗体，但是多克隆抗体相比单克隆抗体可能存在特异性不强的问题，有可能有假阳性结果的产生。具体到本专利技术，所述病毒抗体虽然可以采用多克隆抗体，但是单克隆抗体具有更明显的优势，因此是本专利技术的优选，制备所述单克隆抗体的方法比如可以是用相应病毒免疫动物，如鼠，取动物脾脏B细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，从中获取特异性较强的单克隆抗体。第二方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的乳胶微球免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：（1）制备乳胶微球垫，在乳胶微球垫上包被乳胶微球标记的重组鼠抗人新型冠状病毒第一抗体；（2）制备硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上重组鼠抗人新型冠状病毒第二抗体作为检测线，包被重组羊抗鼠新型冠状病毒抗体作为质控线；（3）在PVC底板上从左到右依次搭接样品垫、乳胶微球垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸，即得。本专利技术制备方法中，所述抗体包被为本领域的常规技术手段，没有特殊限定，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择和制备。本专利技术制备方法中，抗体包被的抗体包被缓冲液为PBS缓冲液或PB缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。所述PBS缓冲液的pH值为6-8.5，优选为7-8。所述PB缓冲液的pH值为7-8，优选为7.2-7.4。本专利技术制备方法中，所述乳胶微球垫的制备，包括以下步骤：（1）器皿洗干净，采用氢氧化钠缓冲液将乳胶微球颗粒的pH值调整至8.5，加入器皿中，再向其中加入终浓度10％的分离剂，再加入重组鼠抗人新型冠状病毒第一抗体稀释液至终浓度30μg/mL，搅拌40min，得到乳胶微球溶液；（2）向步骤（1）得到的乳胶微球溶液中加入10％封闭液至终浓度到1％进行封闭15min；所述封闭液为酪蛋白和/或BSA溶液；（3）将步骤（2）得到的乳胶微球溶液使用4℃、12000rpm进行离心40min，离心后去上清，使用复溶液复溶沉淀，得到重组鼠抗人新型冠状病毒第一抗体标记液；所述复溶液为0.015%吐温20和0.015%BSA两种溶液的混合；（4）将步骤（3）得到的重组鼠抗人新型冠状病毒第一抗体标记液使用喷金划膜仪按0.1μL/mm进行喷涂到乳胶微球垫上；（5）将步骤（4）的乳胶微球垫在37℃烘箱中干燥240本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于新型冠状病毒抗原的乳胶微球免疫层析试纸条，包括PVC底板，其特征在于：/n所述PVC底板上从左到右依次搭接样品垫、乳胶微球垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸；/n所述乳胶微球垫上包被有乳胶微球标记的重组鼠抗人新型冠状病毒第一抗体；/n所述硝酸纤维素膜上包被有重组鼠抗人新型冠状病毒第二抗体作为检测线，以及包被有重组羊抗鼠新型冠状病毒抗体作为质控线。/n

【技术特征摘要】
1.基于新型冠状病毒抗原的乳胶微球免疫层析试纸条，包括PVC底板，其特征在于：
所述PVC底板上从左到右依次搭接样品垫、乳胶微球垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸；
所述乳胶微球垫上包被有乳胶微球标记的重组鼠抗人新型冠状病毒第一抗体；
所述硝酸纤维素膜上包被有重组鼠抗人新型冠状病毒第二抗体作为检测线，以及包被有重组羊抗鼠新型冠状病毒抗体作为质控线。


2.根据权利要求1所述的乳胶微球免疫层析试纸条，其特征在于：所述乳胶微球标记的重组鼠抗人新型冠状病毒第一抗体的浓度为3-18μg/mL，其在乳胶微球垫上的包被量为200uL；
所述重组鼠抗人新型冠状病毒第二抗体的浓度为0.5-3mg/ml，包被量为30uL；
所述重组羊抗鼠新型冠状病毒抗体的浓度为0.5-3mg/ml，包被量为30uL。


3.根据权利要求1所述的乳胶微球免疫层析试纸条，其特征在于：所述乳胶微球垫上还包括分离剂，所述分离剂为酪蛋白、BSA或PEG6000中的任意一种或至少两种的组合。


4.根据权利要求3所述的乳胶微球免疫层析试纸条，其特征在于：所述分离剂为浓度10％的PEG6000。


5.根据权利要求1所述的乳胶微球免疫层析试纸条，其特征在于：所述乳胶微球垫上的乳胶微球颗粒的粒径为300-400nm。


6.根据权利要求1所述的乳胶微球免疫层析试纸条，其特征在于：所述检测线的距离为3-5cm，检测线与质控线的距离为3-5cm，检测线和质控线相互不受干扰。


7.根据权利要求1所述的乳胶微球免疫层析试纸条，其特征在于：所述样品垫为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜；所述乳胶微球垫为玻璃纤维膜。
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈真诚，张启韩，赵飞骏，申琳，肖皓霖，操良丽，
申请(专利权)人：桂林电子科技大学，
类型：发明
国别省市：广西;45