一种测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法技术

本发明专利技术涉及一种测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法，属于生物检测领域。该方法采用高效液相色谱法

【技术实现步骤摘要】
一种测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法


[0001]本专利技术涉及一种测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法，属于生 物检测领域。

技术介绍

[0002]双氯芬酸钠(Disclofenac sodium)为苯乙酸类衍生物，化学名称为2
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[(2,6
‑ꢀ
二氯苯基)氨基]苯乙酸钠，是最常用的非甾体抗炎药(NSAIDs)之一。由于其 胃肠道的不良反应限制了口服剂型的应用，非全身性给药途径成为给药的研究热 点。双氯芬酸依泊胺凝胶为主要用于肌肉、软组织和关节炎症治疗的外用制剂， 国外已上市，国内尚在研发中。双氯芬酸钠依泊胺凝胶局部给药后，在体内以双 氯芬酸钠的形式存在，其疗效与给药部位组织浓度有关。人与猪的皮肤组织结构 和生理学特点极为相似，巴马小型猪是评价经皮吸收药物的最优模型。猪皮肤样 本相对于其他组织样本，韧性大，较难匀浆，因此建立快速、易操作、专属性强 的测定巴马小型猪皮肤中双氯芬酸钠浓度的方法是十分必要的。
[0003]目前关于猪皮肤中双氯芬酸钠浓度的测定方法，国内尚未见文献报道；国外 仅有一篇文献(Skin permeability and pharmacokinetics of diclofenac epolamineadministered by dermal patch in Yorkshire
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Landrace pigs，Journal of Pain Research， 2012:5 401
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408)进行了报道，文献中皮肤样本处理方法为液
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液萃取法：取皮肤 样本，加入适量的0.1mol/L NaOH溶液，于60℃烘箱中放置24h，匀浆后，加 入适量的0.1mol/L HCl溶液及内标，乙酸乙酯作为提取溶剂，提取后蒸干，用 0.1ml的50％二甲亚砜复溶。液相系统条件：5mmol/L甲酸铵溶液
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甲醇(95︰5) (含0.01％甲酸)为流动相A，甲醇为流动相B，流动相A︰流动相B洗脱比例 为45︰55，等度洗脱。此文献方法灵敏度虽高，但样本处理方法较为繁琐，采 用液
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液萃取法，乙酸乙酯作为提取溶剂，容易挥发，且具有低毒性；蒸干步骤 时间长，且操作中易引起交叉污染；流动相组成复杂。
[0004]对于双氯芬酸钠依泊胺凝胶局部给药后，皮肤中双氯芬酸钠的浓度相对较 高，因此在保证一定灵敏度的基础上，为推动国产自制双氯芬酸依泊胺凝胶的研 制以及上市，急需建立一种样品处理简单、分析时间短、方法特异性强的检测方 法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的 方法。
[0006]本专利技术的测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法，其包括采用高 效液相色谱法
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电喷雾离子化串联质谱法即LC
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MS/MS法来检测巴马小型猪皮肤 生物样品中双氯芬酸钠的浓度。
[0007]所述的测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法中皮肤样品称重 后，按比例加入0.1mol/L NaOH溶液，于60℃烘箱中放置一段时间后，放冷至 室温，匀浆；样品测定前预处理采用有机溶剂沉淀法；乙腈作为沉淀溶剂；液相 条件中流动相由0.1％甲酸
水和乙腈组成，梯度洗脱；甲苯磺丁脲作为双氯芬酸 钠皮肤样品测定的内标。
[0008]本专利技术所述的巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法，其具体包括如 下步骤：
[0009](1)皮肤样品处理：取皮肤样品称重后，按1︰4比例加入0.1mol/L NaOH 溶液，于60℃烘箱中放置24h后，放冷至室温，匀浆，作为待测液；
[0010](2)测定前预处理：取20μL待测液，加入180μL内标乙腈溶液，涡旋2 min，4℃，13000r/min离心6min，取上清液，进样1μL进行LC
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MS/MS分析。
[0011](3)双氯芬酸钠采用高效液相色谱法
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电喷雾离子化串联质谱法的高通量测 定方法：取上述待测液1μL进行LC
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MS/MS分析，其中液相系统条件为流动相： A相为0.1％甲酸水，B相为乙腈，梯度洗脱：0～0.5min 10％B，0.5～1.5min10％
→
90％B，1.5～2.0min 90％B，2.0～2.1min 90％
→
10％B；色谱柱为ThermoAccucore C18色谱柱(2.1
×
50mm，2.6μm)；流速：0.4mL/min；柱温：45℃； 进样室温度：15℃；进样量：1.μL；样品检测时间：4min。
[0012]质谱系统条件为：AB SCIEX5500三重四级杆串联质谱系统；离子源：ESI 源；负离子模式；气帘气压力：35psi；碰撞气：8psi；离子化电压：5500psi； 离子源温度：550℃；喷雾气：55psi；辅助加热气：55psi；多重反应监测(MRM) 模式。
[0013](4)双氯芬酸钠标准曲线的测定：取巴马小型猪空白皮肤匀浆液，加入双 氯芬酸钠标准系列溶液，配制成相当于双氯芬酸钠浓度为50，100，400，1000，2500，4000，5000ng/mL的皮肤标准样品，按步骤(2)所述的测定方法操作， 记录色谱图；以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标， 用加权最小二乘法(权重为1/x2)进行回归分析，确定双氯芬酸钠的皮肤样品标 准曲线及其定量限；所述的内标物为甲苯磺丁脲；
[0014](5)巴马小型猪皮肤给药双氯芬酸钠依泊胺凝胶药代动力学试验：采用两 只巴马小型猪(
♀
，1只用于参比制剂，1只用于受试制剂)，肌肉注射舒泰麻醉 后，用异氟烷维持麻醉，背部皮肤给药双氯芬酸依泊胺凝胶，分别于给药一段时 间后取皮肤样本，按照步骤(1)中的皮肤样品处理、步骤(2)测定前预处理和 步骤(3)中的高效液相色谱法
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电喷雾离子化串联质谱法(LC
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MS/MS)的高通 量测定方法以及步骤(4)中所获得双氯芬酸钠标准曲线计算确定不同取样时间 的皮肤中双氯芬酸钠的浓度，并利用Phoenix WinNonlin8.1软件确定双氯芬酸钠 的体内药代动力学参数。
[0015]巴马小型猪皮肤样品的匀浆是巴马小型猪皮肤样品处理过程的关键。猪皮肤 样本相对于其他组织样本，韧性大，较难匀浆，本专利技术中皮肤样本加入适量的碱 液浸泡后，易于匀浆。在保证皮肤样本易于匀浆的同时，还要保证方法的灵敏度， 碱液的加入量过多，会造成皮肤样本中双氯芬酸钠浓度的稀释，因此皮肤样本与 碱液加入量的比例至关重要，本专利技术采用皮肤样本与0.1mol/L NaOH溶液按1 ︰4比例浸泡，既易于皮肤样本的匀浆，又保证了方法的灵敏度。
[0016]皮肤样品匀浆液的测定前预处理是保证LC
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MS/MS法灵敏度的关键本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)皮肤样品处理：取皮肤样品称重后，按比例加入0.1mol/LNaOH溶液，于60℃烘箱中放置一段时间后，放冷至室温，匀浆，作为待测液；取待测液加入内标乙腈溶液，涡旋后离心，取上清液进行LC
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MS/MS分析，所述的内标为甲苯磺丁脲；(2)采用LC
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MS/MS法检测双氯芬酸钠在皮肤样品中的浓度：所用的液相系统条件为：流动相为0.1％甲酸水和乙腈，梯度洗脱；质谱系统采用ESI源，负离子扫描模式。2.如权利要求1所述的一种测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法，其特征在于，取皮肤样品称重后，按1︰4比例加入0.1mol/LNaOH溶液，于60℃烘箱中放置24h后，放冷至室温，匀浆，作为待测液。3.如权利要求1所述的一种测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法，其特征在于，皮肤样品处理时取20μL待测液，加入180μL内标乙腈溶液，涡旋2min，4℃，13000r/min离心6min，取上清液，进样1μL进行LC
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MS/MS分析。4.如权利要求3所述的一种测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法，其特征在于，所述的内标乙腈溶液为200ng/mL的甲苯磺丁脲乙腈溶液。5.如权利要求1所述的一种测定巴马小型猪皮肤生物样品中双氯芬酸钠的方法，其特征在于，LC
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MS/MS法中液相系统条件为流动相：A相为0.1％甲酸水，B相为乙腈，梯度洗脱；...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙淑萌，房绍英，程艳玲，吕慧敏，张岱州，马玉奎，林晓冬，郑晓霞，黄艳妮，赵丹，刘纯，何小华，凌沛学，
申请(专利权)人：山东省药学科学院，
类型：发明
国别省市：