本发明专利技术公开了一种适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组织冷冻及解冻方法。本发明专利技术所述的方法可以解决目前缺少适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组织冻存方法这一问题，填补目前的技术空白，将有力地促进单细胞测序技术在模式动物中的广泛应用；本发明专利技术所述方法采用瞬时速冻技术，在极短的瞬间将组织样本冷冻，避免梯度降温过程中因为细胞仍然具有一定活性而造成冻存过程中转录组发生改变，结果更加准确可靠；本发明专利技术所述的方法避免进行解离、梯度冻存的复杂操作，在40分钟内即可完成组织样本的冻存，时间大大缩短，提高效率，便于开展大量样本的冻存。的冻存。
【技术实现步骤摘要】
一种适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组织冷冻及解冻方法
[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种冷冻及解冻技术，具体涉及一种适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组织冷冻及解冻方法，以及适用于小鼠心脏组织单细胞测序的冻存液和组合试剂。
技术介绍
[0002]单细胞测序技术通过解析单个细胞的转录组，来构建组织的细胞相互作用网络，正日益成为生命科学研究的基础技术手段。保持高的样本细胞活性是开展单细胞测序实验的前提条件，因此组织保存液是开展单细胞测序的重要保障。
[0003]目前单细胞测序样本可以通过冻存的方式来保存。通过在保存液中加入DMSO等冷冻保护剂，将样本保存于超低温冰箱(-80℃)、液氮或干冰中，可以维持细胞活性，保证后续实验顺利开展。《Single Cell Transcriptome Conservation in Cryopreserved Cells and Tissues》对该方案进行了检验，证明这一方法适用于单细胞测序流程。但其方法仍未解决的主要问题有两个：第一，梯度降温时间较长，过程中细胞仍保有一定的代谢活性，会引发细胞转录组的改变，引起“失真”，降低结果的准确性和可靠性，这一点已在文献《Systematic assessment oftissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq work flows》中得到证实；第二，该方法仅适用于细胞样本，组织样本必须首先经过解离后才能进行冻存，增加了操作的复杂度，难以进行大量样本的采集。
[0004]小鼠是医学研究、生物学基础研究常用的动物模型，但目前仍缺少适用于单细胞测序的小鼠组织冻存液，特别是对于心脏等较为“坚硬”的组织，应用传统的小鼠胚胎瞬时冻存技术时(Cryopreservation of Mammalian Embryos，Methods in Molecular Biology,vol.368:Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols,Second Edition)，解冻后的活细胞比例较低，且细胞结团比例等指标无法满足后续单细胞测序实验的要求，因此目前仍然缺少适用于进行单细胞测序的心脏组织的瞬时冷冻保存方法，亟需开发一种新的适用于单细胞测序实验的组织冻存液。
技术实现思路
[0005]现有技术中对于胚胎组织单细胞测序研究比较多，虽然心脏和胚胎都是生物组织，但在生物学特性、理化特性上具有比较大的差异，适用于胚胎的冻存方法并不能简单适用于心脏组织。本专利技术在大量的深入研究和实验的基础上，提供了一种适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组织冷冻及解冻方法，及相应的组织冻存液配方和解冻液配方。
[0006]本专利技术提供了一种适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组织冷冻及解冻方法，包括如下具体步骤：
[0007](1)配置平衡液及冻存液：开始取材前，先分别配置平衡液与冻存液，并将配置好的溶液预冷；
[0008](2)制备样本：将小鼠心脏组织置于离心管中，离心管置于冰上并使用DMEM培养基进行漂洗，然后剪碎，再用DMEM培养基进行漂洗，得组织块；
[0009](3)平衡样本：向步骤(2)得到的组织块中加入平衡液，并在摇床上孵育平衡组织块；
[0010](4)冻存液渗透：将平衡液吸出，加入冻存液，然后在摇床上孵育渗透组织块；
[0011](5)瞬时冷冻及转移保存：将冻存液吸出，组织块转入冻存管中，盖紧管盖，投入液氮中进行冷冻；然后将冻存管转移至-80℃冰箱或者液氮罐中进行长期保存；
[0012](6)解冻试剂准备：开始解冻前，先分别配置解冻液1、2、3、4，并分别预热四种解冻液；
[0013](7)取出冻存样本：将-80℃冰箱或者液氮罐中保存的冻存管取出，打开管盖，加入解冻液1，室温下放置；
[0014](8)解冻液孵育：将组织块转移到离心管中，向冻存管中再加入解冻液1，室温下，摇床上孵育；然后将解冻液1吸出，加入解冻液2，室温下，摇床上孵育；将解冻液2吸出，加入解冻液3，室温下，摇床上孵育；将解冻液3吸出，加入解冻液4，室温下，摇床上孵育。
[0015]本专利技术的创造性手段主要在于溶液的配方，特别是冻存液的配方：即配方是特异性的适用于小鼠心脏组织单细胞测序的冻存和解冻的，同时冻存和解冻的操作过程对溶液能够发挥功效也具有关键的决定作用。此外，由于生物材料的特性，决定了组织冻存和解冻必须遵循本专利技术中提到的依次进行平衡和渗透的步骤。另外，就小鼠心脏组织单细胞测序而言，本专利技术中涉及的各溶液的配方以及操作步骤，在本专利技术之前均未见报道。
[0016]步骤(1)中，优选地，所述平衡液包含以下成份(终浓度)：20％(v/v)乙二醇、20％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS、DMEM培养基。
[0017]步骤(1)中，所述冻存液包含以下成份(终浓度)：1.5mol/L蔗糖、20％～30％(v/v)乙二醇、30％(v/v)甘油、20％(w/v)FBS、DMEM培养基；优选地，为1.5mol/L蔗糖、30％(v/v)乙二醇、30％甘油、20％(w/v)FBS、DMEM培养基。
[0018]步骤(1)中，所述成份分别购自：乙二醇(Sigma-Aldrich，V900208)；甘油(Sigma-Aldrich，G5516)；FBS(Thermo Fisher Scientific,10100139C)；蔗糖(Sigma-Aldrich，V900116)；DMEM培养基(ATCC，30-2002)。
[0019]步骤(1)中，所述预冷的温度为0～5℃；优选地，为放置冰上预冷。
[0020]步骤(2)中，进行DMEM培养基冲洗的目的是将样本上的血液充分洗涤。
[0021]步骤(2)中，所述DMEM培养基冲洗的次数为1-3次；优选地，为3次。
[0022]步骤(2)中，加入的DMEM培养基用量为5～10mL；优选地，为10mL。
[0023]步骤(2)中，所述小鼠心脏组织，为离体后不超过30分钟的组织样本；优选地，为离体后5分钟以内的组织。
[0024]步骤(2)中，所述小鼠为0～4周大的小鼠；优选地，为2～3周。
[0025]步骤(2)中，所述冰是指制冰机产生的碎冰，装于适当大小的泡沫盒中，离心管插于碎冰内。
[0026]步骤(2)中，所述DMEM培养基为事先预冷的，其温度为0～5℃；优选地，为冰上预冷。
[0027]步骤(2)中，所述组织块的厚度不超过5mm；优选地，为2～3mm。
[0028]步骤(3)中，所述孵育的温度为20～25℃；优选地，为25℃。
[0029]步骤(3)中，所述加平衡液的体积为5～10mL；优选地，为10mL。
[0030]步骤(3)中，所述平衡的时间为10～30分钟；优选地，为25分钟。
[0031]步骤(3)中，所本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种适用于小鼠心脏组织单细胞测序的组织冷冻及解冻方法，其特征在于，包括如下具体步骤：(1)配置平衡液及冻存液：开始取材前，先分别配置平衡液与冻存液，并将配置好的溶液预冷；(2)制备样本：将小鼠心脏组织置于离心管中，离心管置于冰上并使用DMEM培养基进行漂洗，然后剪碎，再用DMEM培养基进行漂洗，得组织块；(3)平衡样本：向步骤(2)得到的组织块中加入平衡液，并在摇床上孵育平衡组织块；(4)冻存液渗透：将平衡液吸出，加入冻存液，然后在摇床上孵育渗透组织块；(5)瞬时冷冻及转移保存：将冻存液吸出，组织块转入冻存管中，盖紧管盖，投入液氮中进行冷冻；然后将冻存管转移至-80℃冰箱或者液氮罐中进行长期保存；(6)解冻试剂准备：开始解冻前，先分别配置解冻液1、2、3、4，并分别预热四种解冻液；(7)取出冻存样本：将-80℃冰箱或者液氮罐中保存的冻存管取出，打开管盖，加入解冻液1，室温下放置；(8)解冻液孵育：将组织块转移到离心管中，向冻存管中再加入解冻液1，室温下，摇床上孵育；然后将解冻液1吸出，加入解冻液2，室温下，摇床上孵育；将解冻液2吸出，加入解冻液3，室温下，摇床上孵育；将解冻液3吸出，加入解冻液4，室温下，摇床上孵育。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述平衡液包含以下成份：20％乙二醇、20％甘油、20％FBS、DMEM培养基；和/或，所述冻存液包含以下成份：1.5mol/L蔗糖、20％～30％乙二醇、30％甘油、20％FBS、DMEM培养基；和/或，所述预冷的温度为0～5℃。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述加入的DMEM培养基为事先预冷的，温度为0～5℃；和/或，所述DMEM培养基的用量为5～10mL；和/或，所述DMEM培养基冲洗的次数为1-3次；和/或，所述小鼠为0～4周大的小鼠；和/或，所述新鲜取材的小鼠心脏组织，为离体后不超过30分钟的组织样本；和/或，所述组织块厚度不超过5mm。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述孵育的温度为20～25℃；和/或，所述加平衡液的体积为5～10mL；和/或，所述平衡的时间为10～30分钟；和/或，所述摇床的转速为50～100rpm。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述孵育的温度为20～25℃；和/或，所述加冻存液的体积为5～10mL；和/或，所述孵育的时间为10～20分钟。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述液氮中冷冻的时间至少为10分钟；和/...
【专利技术属性】
技术研发人员：殷昊，肖云平，王树伟，洪强，赵仕兰，
申请(专利权)人：上海欧易生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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