显微成像的方法及装置制造方法及图纸

本发明专利技术属于显微成像技术领域，具体为一种显微成像的方法及装置。显微成像的方法包括：用照明辐射照明样品，检测检测辐射；检测辐射由照明辐射照明样品引起；捕获至少一个第一图像，第一图像具有从样品发射的检测辐射的强度数据；由校正算法从所述至少一个第一图像中计算出第二图像；第二图像分辨率小于第一图像分辨率。显微成像的装置配置为能够执行所述方法。本发明专利技术可以获得更高分辨率的图像，并且能够适用于快速地动态超分辨显微成像。够适用于快速地动态超分辨显微成像。够适用于快速地动态超分辨显微成像。

【技术实现步骤摘要】
显微成像的方法及装置


[0001]本专利技术属于显微成像
，具体涉及一种显微成像的方法及装置。

技术介绍

[0002]在现代光学成像技术中，荧光显微镜具有可以特异性标记，同时可以对活细胞进行实施动态成像等优势，在生命科学研究中获得了广泛应用。但是传统的光学显微镜由于受到衍射极限的限制，其横向分辨率为200 nm-350 nm，即被限制在半个波长左右。此分辨率限制了其在小于200 nm的亚细胞水平上生命科学领域中的动态研究。其中诸如核孔中心位置（大约30nm）、微管直径（外径约25nm，内径约14nm）和囊泡等一些亚细胞结构尺寸不大于50 nm，甚至不大于30 nm。
[0003]近年来，为了突破衍射极限，多种超分辨光学显微技术被科研工作者相继提出，例如基于单分子定位技术的光激活定位显微术、随机光学重构显微术等，基于可逆饱和光转移过程的受激发射损耗显微术，基于改变照明光空间结构的结构光照明荧光显微术，基于随机光学波动超分辨显微术等。这里“超分辨”是指超过衍射极限的分辨率。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种具有超高图像分辨率、优异成像质量的图像显微成像的方法及装置。
[0005]本专利技术提供了显微成像的方法，包括以下步骤：提供样品；用照明辐射照明样品，并且检测检测辐射，其中，检测辐射由照明辐射照明样品引起；捕获至少一个第一图像，第一图像具有从样品发射的检测辐射的强度数据；以及通过校正算法从至少一个第一图像中计算出第二图像；其中，第一图像具有第一分辨率，第二图像具有比第一分辨率小的第二分辨率。
[0006]在实施例中，检测辐射包括光信号，特别是荧光信号。
[0007]在实施例中，捕获至少一个第一图像采用以下技术中的至少一个：结构光照明显微技术、受激发射损耗显微技术、具有检测器阵列的共聚焦显微技术和/或光激活定位显微技术。
[0008]在实施例中，捕获至少一个第一图像包括生成原始图像的集合，其中采用带有不同相位信息的不同照明方向的结构光照明辐射，生成原始图像的集合；所述原始图像的集合包括对应于具有不同相位信息的不同照明方向的结构光照明辐射所引起的检测辐射从而生成的原始图像。
[0009]在替代的实施例中，捕获至少一个第一图像包括生成原始图像的集合，其中在含有多个检测器元件的检测器阵列中生成原始图像的集合；所述原始图像的集合包括检测辐射在每个检测器元件的检测平面中生成的原始图像。
[0010]在实施例中，捕获至少一个第一图像还包括以下步骤：
基于生成的原始图像的集合，使用第一重构算法重构原始图像，以获得第一图像，其中第一重构算法为三相位重构算法和/或四相位重构算法，第一图像具有样品的检测辐射的强度信息的数据；以及在样品的同一检测区域中，以指定的时间间隔获取至少一个第一图像，其中至少一个第一图像配置为按指定的时间间隔排序的图像序列。
[0011]在实施例中，指定的时间间隔至少不大于50 ms，至少一个第一图像的数量不少于50帧。
[0012]在实施例中，校正算法包括径向波动定位算法，径向波动定位算法配置为针对至少一个第一图像中的每一个第一图像基于径向波动定位算法定位和标记检测辐射的强度中心位置，从而得到标记强度中心位置的至少一个第三图像，其中至少一个第三图像配置为按指定的时间间隔排序的图像序列。
[0013]在实施例中，校正算法还包括相关性算法，相关性算法配置为基于时间序列和至少一个第三图像中的每一个图像中同一像素位置上的强度之间的关系计算出每个像素上的相关因子，并且基于每个像素上的相关因子，以获得第二图像。
[0014]在替代的实施例中，捕获至少一个第一图像还包括以下步骤：基于原始图像的集合，通过径向波动定位算法定位和标记检测辐射的强度的中心位置，并且相应地获得第四图像的集合；用第一重构算法重构第四图像的集合，以获得已经具有标记检测辐射的强度中心位置的第一图像；以及在样品的同一检测区域中，以指定的时间间隔获取至少一个第一图像，其中至少一个第一图像配置为按指定的时间间隔排序的图像序列。
[0015]在实施例中，校正算法包括相关性算法，相关性算法配置为基于时间序列和至少一个第四图像中的每一个图像中同一像素位置上的强度位置之间的关系计算出每个像素上的相关因子，并且基于每个像素上的相关因子，以获得第二图像。
[0016]在实施例中，第一分辨率不大于200 nm，特别是不大于100 nm。
[0017]在实施例中，第二分辨率小于或等于第一分辨率的二分之一，特别地小于或等于第一分辨率的三分之一，特别是不大于30 nm。
[0018]根据另一个方面，提供了显微成像的装置，其配置为执行如上所述的方法。
[0019]根据另一方面，提供的显微成像的装置，包括：照明源模块，所述照明源模块包括提供照明辐射的照明源；照明光学单元，配置为将照明辐射聚焦到要检测的样品中；检测光学单元，配置为布置在照明光学单元的束路径下游，并且在与所述样品的焦平面共轭的平面处获得发射的检测辐射；检测模块，配置为将所获得的检测辐射转换为电信号；以及计算单元，配置为处理具有转换的电信号的原始图像，所述计算单元包括：图像生成模块，配置为生成所述图像的集合；时序图像生成模块，在采集时间中，生成一系列时间相关的多个图像或者多个图像的集合；第一重构模块，配置为采用第一重构算法将图像的集合重构，以得到一帧具有第一分
辨率的图像；定位模块，配置为使用径向波动算法计算并标记图像中的检测辐射的强度中心位置；第二重构模块，采用第二重构算法将多个按时间排列的图像计算并重构出一帧具有第二分辨率的图像；其中，所述第一分辨率大于所述第二分辨率。
[0020]根据另一个方面，提供了显微镜系统，其包括执行如上所述方法的显微成像的装置。
[0021]本专利技术提供了一种显微成像的方法。通过将光学径向波动算法与诸如结构光照明显微技术、具有检测器阵列的共聚焦显微技术等的超分辨荧光显微技术结合，可以获得更高分辨率的图像，并且能够灵活地适用于大范围的超分辨荧光显微技术。
[0022]更具体地，在现存的超分辨显微技术的情况下，例如STORM的单分子显微技术，需要例如光开关荧光蛋白可以用不同光在亮态和暗态之间转换，并且重复多次，直至光漂白；然后采集几千张或几万张图像以获得高分辨荧光图像。在这样的情况下，选择的荧光样品要求具有光稳定性高、不易漂白，对比度高。但是由于需要多次转换荧光状态而照明辐射照射样品的时间较长，从而导致光毒性大，同时由于长时间的观测可能发生一定程度的样品移动或者照明辐射的不均匀，从而产生具有伪影的图像。
[0023]与单分子显微技术相比较，本专利技术的实施例中，获得的图像能够有效地降低图像中的伪影，以改进成像的质量。例如，该方法仅需要几十张或几百张图像，因而具有更快的采集速度，而且减少了样品制备的复杂度，降低对荧光样品的要求，并且因此实现低光毒性。有利的，由于无需对现有系统做附加的硬件改造，从而实现了低系统复杂度、高信噪比、多个信号的高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种显微成像的方法，包括以下步骤：提供样品；用照明辐射照明样品，并且检测检测辐射，其中，所述检测辐射由照明辐射照明所述样品引起；捕获至少一个第一图像，所述第一图像具有从所述样品发射的检测辐射的强度数据；以及通过校正算法从所述至少一个第一图像中计算出第二图像；其中，所述第一图像具有第一分辨率，所述第二图像具有比所述第一分辨率小的第二分辨率。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测辐射包括光信号，特别是荧光信号。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获至少一个第一图像采用以下技术中的至少一个：结构光照明显微技术、受激发射损耗显微技术、具有检测器阵列的共聚焦显微技术和/或光激活定位显微技术。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获至少一个第一图像包括生成原始图像的集合，其中采用带有不同相位信息的不同照明方向的结构光照明辐射，生成原始图像的集合；所述原始图像的集合包括对应于具有不同相位信息的不同照明方向的结构光照明辐射所引起的检测辐射从而生成的原始图像。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获至少一个第一图像包括生成原始图像的集合，其中在含有多个检测器元件的检测器阵列中生成原始图像的集合；所述原始图像的集合包括所述检测辐射在每个检测器元件的检测平面中生成的原始图像。6. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述捕获至少一个第一图像还包括以下步骤：基于生成的原始图像的集合，使用第一重构算法重构所述原始图像，以获得所述第一图像，其中所述第一重构算法为三相位重构算法和/或四相位重构算法，所述第一图像具有样品的检测辐射的强度信息的数据；以及在样品的同一检测区域中，以指定的时间间隔获取所述至少一个第一图像，其中所述至少一个第一图像配置为按所述指定的时间间隔排序的图像序列。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述指定的时间间隔至少不大于50 ms，所述至少一个第一图像的数量不少于50帧。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述校正算法包括径向波动定位算法，所述径向波动定位算法配置为针对所述至少一个第一图像中的每一个第一图像基于所述径向波动定位算法定位和标记所述检测辐射的强度中心位置，从而得到标记所述强度中心位置的至少一个第三图像，其中所述至少一个第三图像配置为按所述指定的时间间隔排序的图像序列。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述校正算法还包括相关性算法，所述相关性算法配置为基于时间序列和所述至少一个第三图像中的每一个图像中同一像素位置上的强度之间的关系计算出每个像素上的相关因子，并且基...

【专利技术属性】
技术研发人员：马炯，王保举，姚龙芳，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：