本发明专利技术公开了一种利用瞬时CRISPR/Cas9系统对耐热酵母基因组进行高效编辑的方法及其应用。本发明专利技术方法不需要构建Cas9蛋白、sgRNA的表达载体，在体外利用PCR的方法分别扩增出Cas9蛋白、sgRNA以及同源重组原件的表达框，混合后转化耐热酵母KU70基因缺陷型菌株即可对其基因组指定位点进行高效编辑。本发明专利技术方法由于不需要构建载体，因而操作简便、实验周期短。由于将Cas9基因线性表达框直接转入细胞，其不会复制和遗传，细胞分裂后自动丢失，因此不需要人工再次去除Cas9的表达，进一步简化操作流程，由于Cas9蛋白表达时间短，又降低了基因编辑过程中的脱靶率。辑过程中的脱靶率。辑过程中的脱靶率。
【技术实现步骤摘要】
一种利用瞬时CRISPR/Cas9系统对耐热酵母基因组进行高效编辑的方法及其应用
[0001]本专利技术属于基因编辑领域，具体涉及一种利用瞬时CRISPR/Cas9系统对耐热酵母基因组进行高效编辑的方法及其应用。
技术介绍
[0002]马克斯克鲁维酵母(分类命名为：马克斯克鲁维酵母Kluyveromycesmarxianus)是一种耐高温、能利用多种底物的、目前已知生长最快的真核生物，其具有从生物质中生产高附加值产品的巨大潜力。然而，由于基因工程性能的局限性，例如马克斯克鲁维酵母的高效的非同源末端重组(NHEJ)能力，几乎完全阻止了同源重组(HR)能力，从而使针对马克斯克鲁维酵母的基因编辑效率十分低下，这大大限制了马克斯克鲁维酵母在工业生物
中替代啤酒酵母。
[0003]近来已有一些使用CRISPR/Cas9基因组编辑系统来快速构建马克斯克鲁维酵母突变体的报道。但是，先前针对克鲁维酵母的CRISPR/Cas9系统需要将Cas9和sgRNA基因整合到基因组中，或者每次针对不同的目标区域需要重新构建Cas9-sgRNA表达质粒，这些条件会限制CRISPR/Cas9系统在耐热酵母中的应用。此外，这些报道仅关注CRISPR/Cas9系统在构建基因敲除菌株中的高效率，而忽略了其在马克斯克鲁维酵母代谢工程中的潜在应用。此前因为缺乏有效和稳定的马克斯克鲁维酵母多拷贝附加型质粒复制系统，以往异源途径是通过整合质粒恢复宿主的生长缺陷而整合到马克斯克鲁维酵母染色体中的。然而，整合型质粒的方法增加了Cas9在宿主菌株中的表达时间，从而增加了脱靶的可能性。此外，使用整合质粒进行的基因操作通常会在宿主基因组内部留下不必要的遗传痕迹，例如耐药基因、多个克隆位点和用于靶基因克隆的大肠杆菌复制子等。因此，利用一种快速且高效的方法对马克斯克鲁维酵母进行精确地基因组编辑是十分必要的。
技术实现思路
[0004]本专利技术旨在提供一种利用瞬时CRISPR/Cas9系统对耐热酵母基因组进行高效编辑的方法及其应用。本专利技术方法不需要构建Cas9蛋白、sgRNA的表达载体，在体外利用PCR的方法分别扩增出Cas9蛋白、sgRNA以及同源重组原件的表达框，混合后转化耐热酵母KU70基因缺陷型菌株即可对其基因组指定位点进行高效编辑。
[0005]本专利技术以XYL2基因编码区为目标区域，提供了基于瞬时CRISPR/Cas9系统对耐热酵母进行基因敲除所需的同源臂长度，KU70基因的影响、转化效率、反应体系。
[0006]本专利技术进一步示范了在基因组整合异源表达框的同时定位需要敲除的基因区域，从而达到快速改造和重构耐热酵母的代谢途径以合成高附加值化合物的目的。具体来说将重组脉孢霉木糖还原酶(NcXR)基因表达框用PCR扩增出来，与遗传筛选标记URA3基因一起转化YZB101菌株，并定位在XYL2基因区域，达到高效表达NcXR的同时敲除XYL2基因的目的，该菌株可以甘油为共培养底物提供还原力将木糖还原为木糖醇，其发酵能力与用传统方法
构建的菌株一致，展示了本专利技术的技术方法在耐热酵母的基因功能研究和快速代谢工程改造中的应用潜力。
[0007]本专利技术利用瞬时CRISPR/Cas9系统对耐热酵母基因组进行高效编辑的方法，首先在体外通过PCR扩增分别获得Cas9蛋白表达框、sgRNA表达框以及同源重组原件，混合后转化耐热酵母KU70基因缺陷型菌株，即可对其基因组指定位点进行高效编辑。
[0008]所述同源重组原件的组成为：上游同源区-筛选标记-下游同源区，针对耐热酵母基因组的目标编辑区域，上下游最短仅需要60bp的同源区，中间的筛选标记为营养筛选标记URA3基因。
[0009]在对耐热酵母进行基因组编辑前需要首先敲除耐热酵母的KU70基因以阻断耐热酵母原本非常高效的非同源重组能力，从而提高其同源重组能力；其次敲除其URA3基因作为同源重组原件成功替换目标区域的遗传筛选标记。
[0010]成功对耐热酵母基因组进行编辑后，不需要人工再次去除Cas9的表达，因为转入的Cas9基因表达框是线性的，其不会复制和遗传，细胞分裂后自动丢失，而且Cas9蛋白表达时间短，因此该方法简化了基因编辑的流程，同时降低了基因编辑过程中的脱靶率。
[0011]将上述方法用于耐热酵母XYL2基因的敲除，包括以下步骤：
[0012]步骤1：从质粒p414-TEF1p-Cas9-CYC1t(市购获得，购自Addgene公司)扩增Cas9表达框TEF1p-Cas9-CYC1t片段；其中TEF1p是控制cas9表达的启动子，CYC1t是控制Cas9表达的终止子。
[0013]步骤2：从质粒p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t(市购获得，购自Addgene公司)中扩增SNR52p启动子片段和gRNA.CAN1.Y-SUP4t-CYC1t片段，并将这两个片段分别连接到pUC19质粒，得到质粒pZB089和pZB090；
[0014]步骤3：利用融合PCR技术构建SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t-CYC1t重组片段，其中的gRNA序列是特异性针对XYL2基因的；
[0015]步骤4：将TEF1p-Cas9-CYC1t片段、SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t-CYC1t片段、XYL2同源敲除片段混合(1μg:1μg:3μg)，乙醇沉淀纯化，化学转化YZB101菌株(构建过程已公开，Zhang et.al.2020a)；
[0016]步骤5：将转化后的菌液涂布于不含尿嘧啶的合成培养基平板，对长出的转化子复筛，并提取基因组做PCR鉴定和测序鉴定，对于单基因的敲除，其效率值在95％以上。
[0017]本专利技术基于瞬时CRISPR/Cas9系统可以实现耐热酵母木糖代谢途径的快速重构。具体来说，将两个需要重组表达的目的基因表达框定位于耐热酵母XYL2基因的位置，达到重组表达目的基因的同时敲除另一个基因的目的，具体包括如下步骤：
[0018](1)利用上述方法分别获得TEF1p-Cas9-CYC1t片段和SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t-CYC1t片段；
[0019](2)从质粒pZJ011(构建过程已公开，Zhang et.al.2014)扩增出NcXR的重组表达框，从质粒YEUGAP(构建过程已公开，Zhang et.al.2014)扩增出URA3的表达框；将两个重组表达片段各自用PCR的方法扩增，两个重组表达片段间需要加上至少60bp重叠序列，两个末端加上至少60bp定位目标区域的同源臂。
[0020](3)将TEF1p-Cas9-CYC1t片段、SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t-CYC1t片段、NcXR的重组表达框和URA3的表达框混合(1μg:1μg:3μg:3μg)，乙醇沉淀纯化，化学转化YZB101菌株
(构建过程已公开，Zhang et.al.2020a)；
[0021](4)将转化后的菌液涂布于不含尿嘧啶本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种利用瞬时CRISPR/Cas9系统对耐热酵母基因组进行高效编辑的方法，其特征在于：首先在体外通过PCR扩增分别获得Cas9蛋白表达框、sgRNA表达框以及同源重组原件，混合后转化耐热酵母KU70基因缺陷型菌株，即可对其基因组指定位点进行高效编辑。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述同源重组原件的组成为：上游同源区-筛选标记-下游同源区，针对耐热酵母基因组的目标编辑区域，上下游最短需要至少60bp的同源区，中间的筛选标记为营养筛选标记URA3基因。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在对耐热酵母进行基因组编辑前需要首先敲除耐热酵母的KU70基因以阻断耐热酵母原本非常高效的非同源重组能力，从而提高其同源重组能力；其次敲除其URA3基因作为同源重组原件成功替换目标区域的遗传筛选标记。4.利用权利要求1、2或3所述的方法敲除耐热酵母XYL2基因，其特征在于包括以下步骤：步骤1：从质粒p414-TEF1p-Cas9-CYC1t扩增Cas9表达框TEF1p-Cas9-CYC1t片段；其中TEF1p是控制cas9表达的启动子，CYC1t是控制Cas9表达的终止子；步骤2：从质粒p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t中扩增SNR52p启动子片段和gRNA.CAN1.Y-SUP4t-CYC1t片段，并将这两个片段分别连接到pUC19质粒，得到质粒pZB089和pZB090；步骤3：利用融合PCR技术构...
【专利技术属性】
技术研发人员：张标，任丽丽，李峰，徐大勇，
申请(专利权)人：淮北师范大学，
类型：发明
国别省市：
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