一种提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平的方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平的方法，该方法是通过共同过表达蛋白合成与分泌途径相关的辅助蛋白以提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平。共同过表达优选包括以下任意一种情形：(i)目的蛋白基因与一种辅助蛋白的单拷贝基因的共同过表达；(ii)目的蛋白基因与一种辅助蛋白的多拷贝基因的共同过表达；(iii)目的蛋白基因与多种辅助蛋白的不同拷贝数基因的共同过表达。本发明专利技术通过对提升方法的整体作用机制进行改进，通过共同过表达蛋白合成与分泌途径相关的辅助蛋白以提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平，可显著提高解脂耶氏酵母中目的蛋白的产量。目的蛋白的产量。目的蛋白的产量。

【技术实现步骤摘要】
一种提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平的方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，更具体地，涉及一种提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平的方法，该方法通过共同过表达蛋白合成与分泌途径相关的辅助蛋白提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平。

技术介绍

[0002]解脂耶氏酵母是一种应用广泛的Generally recognized as safe(GRAS)安全型非常规酵母，其多种亚型菌株已完成基因组测序，目前已有超过180种蛋白在该宿主中成功表达。基因工程菌中目的蛋白表达水平受多种因素的影响，如密码子偏好性、启动子、信号肽、基因剂量、蛋白合成与分泌、发酵培养工艺等。目前，解脂耶氏酵母中提高目的蛋白表达水平的研究主要集中于密码子偏好、启动子、基因剂量、工程菌培养工艺等方面，但缺乏通过优化蛋白合成与分泌途径提高目的蛋白表达水平的方法。
[0003]在解脂耶氏酵母中，诸多辅助因子参与蛋白合成与分泌过程。例如，隶属于Hsp70蛋白家族的内质网驻留蛋白Kar2可以结合多肽并保护其结构，且为多肽穿越内质网提供能量来源；Kar2的辅因子Sls1可调节Kar2活性，并直接参与蛋白共翻译易位过程。另外，Kar2也可与多功能I型跨膜蛋白Ire1相结合，从而影响细胞中的未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)；而Sls1可促使Kar2由ADP结合状态变为ATP结合状态，以利于Kar2和Ire1之间的相互作用。
[0004]蛋白质合成与分泌途径的辅助因子可充当每个质量控制点的传感器和效应器，以保证整个过程的稳态及蛋白的正常加工成熟。然而，为获得更高的蛋白产量，工程菌中的目的蛋白通常需要过量表达，但参与蛋白质合成与分泌的辅助因子含量有限，导致蛋白合成与分泌的稳态难以维持，进而限制了工程菌中目的蛋白的表达量。因此，在目的基因工程菌中过表达蛋白质合成与分泌相关辅助蛋白以增加其含量，可能有助于缓解上述限制并进一步提高目的蛋白的表达水平。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术的目的在于提供一种提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平的方法，其中通过对提升方法的整体作用机制进行改进，通过共同过表达蛋白合成与分泌途径相关的辅助蛋白以提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平，可显著提高解脂耶氏酵母中目的蛋白的产量。
[0006]为实现上述目的，按照本专利技术，提供了一种提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平的方法，其特征在于，该方法是通过共同过表达目的蛋白基因、以及与蛋白合成与分泌途径相关的辅助蛋白基因，以提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平。
[0007]作为本专利技术的进一步优选，所述共同过表达具体包括以下任意一种情形：
[0008](i)目的蛋白基因与一种辅助蛋白的单拷贝基因的共同过表达；
[0009](ii)目的蛋白基因与一种辅助蛋白的多拷贝基因的共同过表达；
[0010](iii)目的蛋白基因与多种辅助蛋白的不同拷贝数基因的共同过表达。
[0011]作为本专利技术的进一步优选，所述共同过表达优选为目的蛋白基因与多种辅助蛋白的不同拷贝数基因的共同过表达。
[0012]作为本专利技术的进一步优选，所述蛋白合成与分泌途径相关的辅助蛋白，能够直接或间接参与解脂耶氏酵母中蛋白合成与分泌途径。
[0013]作为本专利技术的进一步优选，所述辅助蛋白优选选自Sls1、Kar2、Pdi、Hac1、Ire1、Hrd1、Bmh2。
[0014]作为本专利技术的进一步优选，所述目的蛋白为解脂耶氏酵母同源蛋白或异源蛋白。
[0015]通过本专利技术所构思的以上技术方案，与现有技术相比，通过共同过表达目的蛋白基因与至少一种辅助蛋白的单拷贝基因，能够有效提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平。基于本专利技术，可以将解脂耶氏酵母中蛋白合成与分泌途径相关的辅助蛋白基因整合入含目的基因的工程菌中，实现目的基因和辅助蛋白基因的过量共表达，并通过过表达蛋白合成与分泌途径相关的辅助蛋白提高解脂耶氏酵母中目的蛋白的表达水平。
[0016]与酿酒酵母等表达系统相比，解脂耶氏酵母中的蛋白表达实例和有关蛋白合成与分泌途径的研究均较少，而筛选标记可用性不足、定点无标记整合效率较低等问题，又进一步限制了解脂耶氏酵母中的相关研究的进行。本专利技术选取直接或间接参与解脂耶氏酵母中蛋白合成与分泌途径的辅助蛋白，分别运用专利“一种解脂耶氏酵母中目的基因多次无痕整合系统及方法”(中国专利申请号：201910747704.8)中的整合方法和常规整合方法将辅助蛋白与目的蛋白共同过表达，显著提高解脂耶氏酵母目的蛋白的表达水平，弥补了该宿主中相关策略方法的不足，为解脂耶氏酵母蛋白表达系统的开发及完善奠定坚实的基础。
附图说明
[0017]图1为质粒Cre-Y2-sls1、Cre-Y3-sls1、Cre-Y2-kar2、Cre-Y3-kar2图谱。其中，Ura3为解脂耶氏酵母尿嘧啶缺陷型筛选标记；pPOX2-cre-lip2t为油酸诱导的cre基因表达盒；lox71为左臂突变型lox位点，lox66为右臂突变型lox位点，三角形箭头表示其序列方向；hp12d-sls1-XPR2t为辅助蛋白基因sls1表达盒，hp12d-kar2-XPR2t为辅助蛋白基因kar2表达盒；Leu2作为基因组整合位点leu2基因的同源片段；Amp-ori为大肠杆菌氨苄青霉素抗性基因表达盒及质粒复制起点。
[0018]图2为菌株FY5-4rml-sls1酶活力示意图。
[0019]图3为菌株FY5-4rml-kar2和FY5-4rml-2kar2酶活力示意图。
[0020]图4为菌株FY5-4rml-kar2-sls1酶活力示意图。
[0021]图5为质粒Ura-kar2图谱。其中，Ura3为解脂耶氏酵母尿嘧啶缺陷型筛选标记，且作为基因组整合位点的同源片段；pTEF-kar2-lip2t为辅助蛋白基因表达盒；Amp-ori为大肠杆菌氨苄青霉素抗性基因表达盒及质粒复制起点。
[0022]图6为菌株Po1f-3rol-kar2酶活力示意图。
[0023]图7为菌株FY5-4rml、FY5-4rml-sls1、FY5-4rml-kar2、FY5-4rml-2kar2和FY5-4rml-kar2-sls1酶活力对比示意图。
具体实施方式
[0024]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0025]本专利技术以米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase，RML，UniProtKB/Swiss-Prot：P19515)和米根霉脂肪酶(Rhizopus oryzae lipase，ROL，UniProtKB/Swiss-Prot：G8本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平的方法，其特征在于，该方法是通过共同过表达目的蛋白基因、以及与蛋白合成与分泌途径相关的辅助蛋白基因，以提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平。2.如权利要求1所述提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平的方法，其特征在于，所述共同过表达具体包括以下任意一种情形：(i)目的蛋白基因与一种辅助蛋白的单拷贝基因的共同过表达；(ii)目的蛋白基因与一种辅助蛋白的多拷贝基因的共同过表达；(iii)目的蛋白基因与多种辅助蛋白的不同拷贝数基因的共同过表达。3.如权利要求1所述提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平的方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫云君，周清华，焦梁成，李文娟，李云翀，张后今，阎金勇，徐莉，杨敏，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：