一种基于MLPA-NGS技术的DMD和SMA的拷贝数变异检测试剂盒及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种基于MLPA

【技术实现步骤摘要】
一种基于MLPA-NGS技术的DMD和SMA的拷贝数变异检测试剂盒及其用途


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种基于MLPA-NGS技术的DMD和SMA的拷贝数变异检测试剂盒及其用途。

技术介绍

[0002]杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是一种X连锁的致死性隐性遗传病，为儿童期最常见的遗传性肌肉病，发病率约为1/3500活产男婴。以进行性肌肉变性、无力和肌肉萎缩为特点，临床表现为早期生长发育轻度延迟，学会走路后常见上楼和蹲起费力，多数患儿在5岁时症状明显而得以确诊，未经治疗的情况下肌力逐渐下降，约十几岁后丧失行走能力而依赖轮椅生活，随后呼吸、骨骼、心脏并发症逐渐出现，平均死亡年龄约19岁。此外也可出现非进行性认知功能障碍。DMD是由于编码抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的基因(DMD；locus Xp21.2)突变的结果，也被称为抗肌萎缩蛋白病。
[0003]在DMD的变异中，大约2/3来自母亲，不到1/3是新发突变。携带致病基因的男性发病，而女性不出现或出现轻微临床症状。携带致病基因的母亲有50％的几率将突变的DMD基因遗传给下一代。
[0004]约70％的DMD患者是由于DMD基因中一个或多个外显子的拷贝数变异引起的，其中缺失突变的两个热区为外显子45～54和外显子3～22；重复突变的热区主要为3～11和21～37外显子区域；其余的30％为点突变或微缺失。点突变没有显著的分布热点。
[0005]对于DMD的基因检测方法主要包括：多重PCR技术，多重连接依赖性探针扩增(MLPA)技术，NGS技术，芯片技术等，目前最为常用的手段为MLPA技术。
[0006]脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)是一组以脊髓前角细胞(有时也累及脑干运动神经元)变性和缺失为特征的遗传性疾病，临床表现为肌无力和肌萎缩，人群发病率为1/6 000～1/10 000，携带者频率为1/40～1/60，是儿童期常染色体隐性遗传性疾病。SMA的致病基因是SMN基因，该基因包括8个外显子，同一条染色体上有二个非常相似的拷贝，一般命名为SMN1和SMN2，二个拷贝之间仅在各自的3
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端有5bp不同，其中2bp在外显子7和8上，利用这一碱基差异可区分SMN1、SMN2及用作SMA的分子学诊断。数据显示，SMA患者中，约95％为SMN1基因第7和第8外显子纯合缺失或第7外显子纯合缺失所致，5％为SMN1杂合缺失、点突变或SMN1基因转化为SMN2基因所致。2013年上海对1 741例无症状孕妇进行SMA携带者筛查，检出SMN1拷贝数为1的SMA携带者45例，上海地区正常人群此致病基因携带率约为1/39。
[0007]对于SMA的基因检测有多种方法，如Sanger法测序，短片段多重定量PCR(QMPSF)，限制性片段长度多态性(RFLP)，实时荧光定量PCR(real-timePCR)，变性高效液相色谱(DHPLC)，聚合酶链式限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)等，但目前最为常用的方法是MLPA方法。

技术实现思路

[0008]为了克服现有技术的上述缺陷，本专利技术的目的在于提供一种基于MLPA-NGS技术的DMD和SMA的拷贝数变异检测试剂盒及其用途。
[0009]本专利技术公开的试剂盒可以同时检测DMD基因的79个外显子和SMN基因的8个外显子，并可给出SMN1和SMN2的外显子7和外显子8的拷贝数，更加方便快捷，为后续的研究能够提供大量和快速的数据。
[0010]一种基于MLPA-NGS技术的DMD和SMA的拷贝数变异检测试剂盒，包括：
[0011]DMD探针集，所述DMD探针集如SEQ No.1-160所示；通过所述针对性地对DMD基因79个外显子的80个位点(第一外显子包含两个检测位点)进行检测，从而反映DMD基因各外显子的拷贝数。这对于全面检测DMD的拷贝数变异，防止漏检是极为重要的；
[0012]SMN探针集，所述SMN探针集如SEQ No.161-184所示；
[0013]以检测SMN1的第7、8外显子，SMN2的第7、8外显子的相对拷贝数，而且为不区分SMN1和SMN2的所有8个外显子分别设计了检测探针。如检测发现SMN1的第7、8外显子杂合缺失，其它不加区分的外显子的相对拷贝数为3，那么，就可以相互印证地表明SMN1的第7、8外显子杂合缺失是真实的，可信的，双证据的；
[0014]如果检测发现SMN1的第7外显子为杂合缺失，而SMN2第7外显子为扩增(3
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)，而其它不区分SMN1和SMN2的外显子的相对拷贝数仍然为4，那么，就可以推断SMN1的第7外显子转化为SMN2的第7外显子，而不是发生了SMN1的真实的缺失和SMN2的真实的扩增。
[0015]引物集，所述引物集如SEQ No.215-234所示，所述引物集为带有index的、扩增后无需加接头可直接进行高通量测序的引物的集合；
[0016]所述引物集包括用于扩增连接产物的上游引物集和下游引物集。每条上游引物上带有一个8个碱基的index，同样地，每条下游引物也带有一个8碱基的index。每个样品在扩增时，只需要使用一条上游引物和一条下游引物。当多个带有不同index的产物混合后，根据index序列可区分样品。
[0017]在本专利技术的一个优选实施例中，所述试剂盒当中还包括内参探针集或外参探针集，所述内参探针集如SEQ No.185-210所示；
[0018]所述内参基因探针集所包含的位点，分别位于第4、5、6、7、9、17、X、Y染色体上，染色体位置具有很好的代表性，同时避开了容易变异的第21号染色体，作为内参基因具有很好的稳定性；而X、Y染色体检测不但可判断X、Y的拷贝数，而且可以进一步地判断受检者性别。内参基因作为判断DMD基因和SMN基因相对拷贝数的主要参考依据，在基因组中是稳定的。
[0019]所述外参探针集如SEQ No.211-214所示；
[0020]所述外参探针集所包含的探针，是作为预先添加的模板使用的，其两端已经预置了扩增引物的结合位点。该预加模板浓度极低，在DNA解链、探针与模板杂交、探针连接等步骤正常的情况下，不会影响正常连接探针的扩增；在体系中未添加gDNA，或杂交失败，或连接失败的情况下，由于仅有这些预加模板可作为扩增的模板，其在最终扩增产物中占比极高。如果扩增产物中不但其它探针无影无踪，而且连外参探针都没有扩增产物，那么可以推测扩增环节存在问题。
[0021]在本专利技术的一个优选实施例中，所述DMD探针集、SMN探针集、内参基因探针集、外
参探针集混合得DMD-SMA探针工作液，所述混合探针所用的溶液为探针溶解液(任选AE溶液或PBS溶液或其他探针溶解液，稀释倍数范围为0-10X)，混合后每条探针的浓度为以2fMol/μL为参照上下浮动1000倍以内；
[0022]所述外参探针集当本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于MLPA-NGS技术的DMD和SMA的拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于，包括：DMD探针集，所述DMD探针集如SEQ No.1-160所示；SMN探针集，所述SMN探针集如SEQ No.161-184所示；引物集，所述引物集如SEQ No.215-234所示。2.如权利要求1所述的一种基于MLPA-NGS技术的DMD和SMA的拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒当中还包括内参探针集或外参探针集，所述内参探针集如SEQ No.185-210所示；所述外参探针集如SEQ No.211-214所示。3.如权利要求1或2当中任意一项所述的一种基于MLPA-NGS技术的DMD和SMA的拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于，所述DMD探针集、SMN探针集、内参基因探针集、外参探针集混合得DMD-SMA探针工作液，所述混合探针所用的溶液为探针溶解液；混合后每条探针的浓度为以2fMol/μL为参照上下浮动1000倍以内；所述外参探针集当中的Addref1，Addref2，Addref3，Addref4的拷贝数分别为300,80,20,5拷贝/μL。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨永臣，于广军，张泓，丁国徽，
申请(专利权)人：上海市儿童医院，
类型：发明
国别省市：