一种神经和精神类疾病基因SNP位点分型优化的方法技术

本发明专利技术公开了一种神经和精神类疾病基因SNP位点分型优化的方法，包括以下步骤：1）提取DNA；2）对DNA进行PCR扩增；3）纯化PCR扩增产物；4）对纯化后的PCR扩增产物进行延伸；5）纯化延伸产物；6）上测序仪；7）分析延伸产物的荧光标记和长度信息。本发明专利技术基于SNaPshot技术，针对不同SNP位点设计不同长度的和PCR扩增引物和延伸引物来做到多个SNP在一个反应体系中进行分型，可在21个位点同时分型。由于此方法为四色荧光标记，所以可以针对各种SNP类型进行分类，同时还可以对插入、缺失进行分析。分析得到神经和精神类疾病者的基因分型后，有利于医生的对症下药。的对症下药。的对症下药。

【技术实现步骤摘要】
一种神经和精神类疾病基因SNP位点分型优化的方法


[0001]在本专利技术涉及基因识别
，具体涉及一种神经和精神类疾病基因SNP位点分型优化的方法。

技术介绍

[0002]神经病即神经系统疾病是指发生于中枢神经系统、周围神经系统、植物神经系统的以感觉、运动、意识、植物神经功能障碍为主要表现的疾病，又称“神经病”。 神经系统跟精神有关系，一个人的情绪出现问题，就很容易导致神经系统方面的疾病，神经系统也是身体的一部分，与其他系统也是息息相关的，在改善神经系统时，改善不良情绪方面，增强身体素质，达到身心健康的目的。
[0003]精神疾病（mental illness）又称精神病，是指在各种生物学、心理学以及社会环境因素影响下，大脑功能失调，导致认知、情感、意志和行为等精神活动出现不同程度障碍为临床表现的疾病。引起精神病的原因很多，如生物因素：由于基因或环境的伤害（如胎儿酒精综合征）导致精神病人与常人相比可能有不同的脑部结构或功能，或者是有不同的神经化学反应，举例来说，许多被诊断有精神分裂症的病人大脑中有肿大的脑室和萎缩的灰质，另外，神经传导物质不平衡也会导致精神疾病。双生子研究证实躁郁症和精神分裂症等精神疾病是会遗传的；心理学因素：心理学家认为矛盾、危机、紧张和创伤可能会导致精神疾病的发生，特别是在一个容易受伤的人身上。例如，一个目睹父母亲杀人的小孩可能会发展出沮丧和紧张的情绪，甚至会得创伤后压力心理障碍症；社会因素：社会学家认为重大事件和情境会导致精神疾病，例如，在社会动荡、战争或遭受天然或人为的疾病时，该地区的人患精神疾病的概率就会高一些，贫穷、无常和资源匮乏和接受援助的地区患精神疾病的概率比富裕、稳定的地区高。精神疾病的基本症状是精神活动紊乱，导致认识、情感、意志、行为等方面的异常，以致不能维持正常精神生活，甚至作出危害自身和社会集体的行为。本研究中21个SNP位点所关联的疾病主要有帕金森氏症、阿兹海默症、偏头痛、抑郁症、躁郁症、癫痫、精神分裂症等神经及精神类疾病。
[0004]每一种神经和精神类疾病包含多种基因分型，不同基因分型对于相关药物的敏感性也不同。因此，在用药前需要了解患者的基因分型，才能利于医师对症下药。
[0005]单核苷酸多态性（SNP）标记分型的手段既有传统的手段如SSCP(single strand conformationpolymorphism)和CAPs(Cleavage Amplification Polymorphisms)等，也有现在较快速的手段如MassARRAY质谱和TaqMan探针方法等，还有基于芯片的 检测手段如DNA芯片技术已经开发出来并迅速被应用和趋于成熟。使用高密度的DNA芯片或微列阵可以同时对上万个SNP的分型。目前SNP已经 广泛地应用于关联分析，基因精细定位和分子标记辅助育种过程中。但是上 述方法都存在一定的缺点：SSCP手段只能用非变性胶，实验条件苛刻，需要常温条件，一般实验室难以达到；CAPs手段实验过程繁琐，一个实验程 序需要耗费很长的时间；MassARRAY质谱和TaqMan探针方法及其他芯片 方法费用相当高昂，一般实验室难以承担。
[0006]SNaPshot技术，是在一个含有测序酶，四种荧光标记的dDNTP，紧挨多态位点5'端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经测序仪跑胶后，根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型，现有技术中的采用SNaPshot （小测序）技术针对SNP 分型一般用于10~30个位点的分型，只有10个同时分型位点，且由于扩增片段长度和荧光染料种类的限制，在一个复合扩增体系中只可以同时扩增较少的SNaPshot基因座，一般为一种荧光物质标记一个基因座，一个扩增体系最多可同时复合4 个SNaPshot基因座。

技术实现思路

[0007]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种神经和精神类疾病基因SNP位点分型优化的方法，适用于有认知、情感、意志和行为等不同程度神经障碍的大脑功能失调症，利用 SNaPshot SNP 分型技术对21个 SNP 位点体系进行优化，针对中等通量（10~50位点）的SNP分型项目进行技术上的改进，将同时分型位点从10个提高到21个，大大提高了分型的通量的准确性，准确性能达99.99%。
[0008]本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：一种神经和精神类疾病基因SNP位点分型优化的方法，包括以下步骤：1）提取样品中的基因组DNA，得到DNA提取液；2）对步骤1）所得的DNA提取液进行PCR扩增，先加入DNA提取液与PCR缓冲溶液、Mg
2+
溶液、 dNTP、DNA聚合酶和第一PCR引物混合反应，再加入等量的DNA提取液与PCR缓冲溶液、Mg
2+
溶液、 dNTP、DNA聚合酶和第二PCR引物反应，得到PCR扩增产物；其中，第一PCR引物由21个SNP基因位点组成，21个SNP基因位点在NCBI中SNP的数据库的rs号为：rs11931074、rs11240572、rs823156、rs6691117、rs116806486、rs67327804、rs9331949、rs2651899、rs909253、rs1006737、rs231779、rs11013860、rs2073831、rs2709736、rs8040009、rs2292096、rs6660197、rs12467383、rs10489202、rs1488935、rs16887244；第二PCR引物由21个SNP基因位点组成，21个SNP基因位点在NCBI中SNP的数据库的rs号为：rs11931074、rs11240572、rs823156、rs6691117、rs116806486、rs67327804、rs9331949、rs2651899、rs909253、rs1006737、rs231779、rs11013860、rs2073831、rs2709736、rs8040009、rs2292096、rs6660197、rs12467383、rs10489202、rs1488935、rs16887244；21个SNP基因位点的引物序列为：rs11931074F：TGGGATGCCTTCACCGTTTGTA，rs11931074R：CAAATGGCAGCCTTCCAAATCAT；rs11240572F：TCTTCCCATGGGCTTTTATTGAATC，rs11240572R：CTCGTGGGGTGGAGAAGAGAGC；rs823156F：GTTCTCTCCGGGCATTCCATTC，rs823156R：ATGCACTGGAAGCAGGGGTCTT；rs6691117F：CAGCTGTTTGAGCTTGTGGGAGA，rs6691117R：CCAGCAAAGTCTTGATGGGTCA；rs116806486F：CAGGACACATCATATTATGCCCATTG，
rs116806486R：TTCCAGGATTGCAGCGGT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种神经和精神类疾病基因SNP位点分型优化的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）提取样品中的基因组DNA，得到DNA提取液；2）对步骤1）所得的DNA提取液进行PCR扩增，先加入DNA提取液与PCR缓冲溶液、Mg
2+
溶液、 dNTP、DNA聚合酶和第一PCR引物混合反应，再加入等量的DNA提取液与PCR缓冲溶液、Mg
2+
溶液、 dNTP、DNA聚合酶和第二PCR引物反应，得到PCR扩增产物；其中，第一PCR引物由21个SNP基因位点组成，21个SNP基因位点在NCBI中SNP的数据库的rs号为：rs11931074、rs11240572、rs823156、rs6691117、rs116806486、rs67327804、rs9331949、rs2651899 、rs909253、rs1006737、rs231779、rs11013860、rs2073831、rs2709736、rs8040009、rs2292096、rs6660197、rs12467383、rs10489202、rs1488935和rs16887244；第二PCR引物由21个SNP基因位点组成，21个SNP基因位点在NCBI中SNP的数据库的rs号为：rs11931074、rs11240572、rs823156、rs6691117、rs116806486、rs67327804、rs9331949、rs2651899、rs909253、rs1006737、rs231779、rs11013860、rs2073831、rs2709736、rs8040009、rs2292096、rs6660197、rs12467383、rs10489202、rs1488935、rs16887244；21个SNP基因位点的引物序列为：rs11931074F：TGGGATGCCTTCACCGTTTGTA，rs11931074R：CAAATGGCAGCCTTCCAAATCAT；rs11240572F：TCTTCCCATGGGCTTTTATTGAATC，rs11240572R：CTCGTGGGGTGGAGAAGAGAGC；rs823156F：GTTCTCTCCGGGCATTCCATTC，rs823156R：ATGCACTGGAAGCAGGGGTCTT；rs6691117F：CAGCTGTTTGAGCTTGTGGGAGA，rs6691117R：CCAGCAAAGTCTTGATGGGTCA；rs116806486F：CAGGACACATCATATTATGCCCATTG，rs116806486R：TTCCAGGATTGCAGCGGTAGGT；rs67327804F：CTCCACCCTCGGGGTCCTAGA，rs67327804R：CTCTCTGCCACGAGGAGGGTTC；rs9331949F：GCCATGCTAAAATACTTACCTTGGACA，rs9331949R：AGCTGGGCTGCAGTACCCTACG；rs2651899F：GAGCGAACACAGGGACGATCTG，rs2651899R：CGGATTTCCGGAATGGCTTTTA；rs909253F：CCGTGCTTCGTGCTTTGGACTA，rs909253R：CCGACCCCCGAGAGAGAGAT；rs1006737F：TCTGCCTGCCCACTGTGTACAG，rs1006737R：ACTGTCCTGAGAGACACTGTGAGGTC；rs231779F：GACTGGAGAGGGGCCTGGTTAG，rs231779R：CGCTGCCTCTCTGCCCTTTATT；rs11013860F：TTGTAGGCACAGAATTTTGGAATGTTAG，rs11013860R：AACTCAGGGGCAGGAAACACAA；
rs2073831F：CCCAGCCATGGGTTACATAGCA，rs2073831R：CGGGTCTTGCAAAAGTCACAGG；rs2709736F：TGGAGGTCATTGTAAAAATCCTGACTG，rs2709736R：TGGTGGTATCCAAACCATGCTTAAT；rs8040009F：TGCATGATGCTGAAGCCAGAAG，rs8040009R：CAAATTGTCCCCCAGTGGAGTG；rs2292096F：TCATGGGCCTAGACTTTCAACAGC，rs2292096R：GCATCCTGAATCCCGGAACAAG；rs6660197F：CCCACCCTTGGCCATTCTTAAC，rs6660197R：ATCCTCATTTGGTGGCTGGAGA；rs12467383F：GCACCTTGCCAGACATGCTTTC，rs12467383R：GCACGTTGTGCAATTTGGTGAG；rs10489202F：TGTGCCTCCAACTTGTCGATCAT，rs10489202R：CGTTTCAGTCTTGGCTGTGTGAC；rs1488935F：CAAAACCCAACGCCACAGGTA，rs1488935R：GGAGATGGTGGAGAGCTGGTCA；rs16887244F：AAAAGCAGCAAGCTCAGGGTGA，rs16887244R：TCACTTGGATTACATGTGGCCTACTTC；3）PCR 产物经核酸外切酶Ⅰ和虾碱性磷酸酶纯化，得到纯化后的PCR扩增产物；4）纯化后的PCR扩增产物与延伸引物混合物、SNaPshot Multiplex Kit溶液和超纯水混合，进行延伸反应，得到延伸产物；其中，延伸引物混合物由21个SNP基因位点的引物组成，21个SNP基因位点在NCBI中SNP的数据库的rs号为：rs11931074、rs11240572、rs823156、rs6691117、rs116806486、rs67327804、rs9331949、rs2651899、rs909253、rs1006737、rs231779、rs11013860、rs2073831、rs2709736、rs8040009、rs2292096、rs6660197、rs12467383、rs10489202、rs1488935、rs16887244；21个SNP基因位点的引物序列为：rs11931074SR：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCAGCCTTCCAAATCATAATTCCCT；rs11240572SF：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATATACATACCACATCCTATTGAACCCA；rs823156SF：TTTTTTTTTTTTTAGACACATACGGGCTTAGACACAGACA；rs6691117SF：TTTTTTTTTTTTTTTTTTAACAGGAGTTTCTTTWCCCTCACTGAGATC；rs116806486SR：TTT...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖华，黄宇东，米丁丹，
申请(专利权)人：广东瑞昊生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：