一种测定牛膝中水龙骨素B含量的方法技术

本发明专利技术提供了一种测定牛膝中水龙骨素B含量的方法，属于中药有效成分的分析检测技术领域。所述检测方法通过分别制备供试品溶液、对照品溶液，然后取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，以乙腈

【技术实现步骤摘要】
一种测定牛膝中水龙骨素B含量的方法


[0001]本专利技术涉及一种中药材中有效成分含量的测定方法，尤其涉及一种测定牛膝中水龙骨素B含量的方法，属于中药有效成分的分析检测


技术介绍

[0002]牛膝为觅科植物牛膝的干燥根，冬季茎叶枯萎时采挖，除去须根和泥沙，捆成小把，晒至干皱后，将顶端切齐，晒干。用于逐瘀通经，补肝肾，强筋骨，利尿通淋，引血下行。用于经闭，痛经，腰膝酸痛，筋骨无力，淋证，水肿，头痛，眩晕，牙痛，口疮，吐血，鲍血。
[0003]文献“β-蜕皮激素和水龙骨素B的混合物对促进对虾蜕皮的生长作用，罗日祥等，1990”中提到：试验β-蜕皮激素和水龙骨素B（2:1）的混合物促进对虾蜕皮生长的作用。其中，牛膝中有效处成分水龙骨素B属于蜕皮甾酮类化合物。文献“怀牛膝对记忆力和耐力的影响，马爱莲等，2013”文献中提到：蜕皮甾酮具有促进学习记忆和改善脑功能障碍的药理活性。文献“蜕皮甾酮对撞击致肺挫伤的影响，吴旭等，2016”中提到：牛膝中的蜕皮甾酮对撞击所致挫伤有一定治疗作用。另，文献“蜕皮甾酮软膏对家兔创面愈合的影响，李钰珑等，2008”中可知：蜕皮甾酮软膏有明显促进伤口愈合的作用，与云南白药作用相当。由此可见，蜕皮甾酮类化合物有着良好的药理作用，而水龙骨素B属于蜕皮甾酮类化合物，也有着蜕皮甾酮类化合物的性质，因此，对水龙骨素B的研究同样意义重大。
[0004]2020版《中国药典》中牛膝和川牛膝的鉴定和含量测定均未涉及水龙骨素B，且目前未有论文、专利等文献公开过牛膝中的水龙骨素B的分析检测、分离纯化制备等。文献“牛膝不同炮制品中化学成分的UPLC-Q-TOF-MS分析，陶益等，2017”中仅公开：比较生牛膝、酒牛膝及盐牛膝的各项质控指标及化学成分的差异，结果表明：生牛膝、酒牛膝及盐牛膝的水分、总灰分及醇溶性浸出物的含量均符合2015年版《中国药典》的要求，运用高分辨质谱鉴定了10个主要化学成分，分别为苄基葡萄糖苷、苄基葡萄糖苷异构体、牛膝甾酮A、水龙骨素B、β-蜕皮甾酮、牛膝甾酮、姜状三七苷R1、人参皂苷Ro、牛膝皂苷Ⅰ和竹节参皂苷Ⅳ。牛膝经酒炙后苄基葡萄糖苷、苄基葡萄糖苷异构体、水龙骨素B、β-蜕皮甾酮和人参皂苷Ro的含量显著升高，而姜状三七苷R1、牛膝皂苷Ⅰ和竹节参皂苷Ⅳ的含量则显著减低；盐炙后苄基葡萄糖苷、苄基葡萄糖苷异构体、牛膝甾酮A、水龙骨素B、β-蜕皮甾酮和牛膝甾酮含量显著升高，而姜状三七苷R1、人参皂苷Ro、牛膝皂苷Ⅰ和竹节参皂苷Ⅳ的含量则显著降低。同时得出：牛膝炮制后酚苷类和甾体皂苷类成分的含量显著上升，而三萜皂苷类成分的含量则显著降低。
[0005]以及，文献“牛膝不同炮制品中化学成分的UPLC-Q-TOF/MS检测分析，胡清宇，2018”中仅公开：分析应用UPLC-Q-TOF/MS对牛膝不同炮制品中化学成分的临床检测价值，结果表明：UPLC-Q-TOF/MS对牛膝不同炮制品中化学成分的临床检测价值在生牛膝、酒牛膝和盐牛膝3种炮制品中差异无统计学意义（P>0.05），但酒牛膝的检验灵敏度和特异性较高，差异具有统计学意义（P<0.05）。同时得出：牛膝含有三萜皂甙、多种多糖、肽类和氨酸类等多种化学成分，应用UPLC-Q-TOF/MS对牛膝不同炮制品中化学成分的临床检测价值确切，对
酒牛膝的灵敏性和特异性较高，值得临床检测其有效成分，以指导临床用药，提供理论和临床实践依据。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在解决现有技术问题，而提出了一种测定牛膝中水龙骨素B含量的方法。在本技术方案中，通过有机溶剂提取有效成分作为供试品溶液，与对照品溶液一并进入高效液相色谱仪中进行测定，可实现牛膝中水龙骨素B的定性和定量检测（检测限可达到0.75μg/mL），为后续牛膝中水龙骨素B的定性、定量的研究，以及为产品质量控制、评价指标提供可靠的检测方法；且本方法操作简便、稳定性高、重复性好及专属性强。
[0007]为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：一种测定牛膝中水龙骨素B含量的方法，包括如下步骤：A．对照品溶液的制备：取对照品水龙骨素B，加甲醇溶解，按浓度呈梯度分布配制至少五份对照品溶液；B．供试品溶液的制备：取供试品牛膝，干燥粉碎后，称牛膝药材粉末1～5g，加入水饱和正丁醇（水：正丁醇=1:1配置）10～40mL，密塞，称定重量，浸泡过夜，超声处理（电磁波频率30～60 kHz，温度为15～30℃），放冷后以水饱和正丁醇补足重量，摇匀，离心（2000r/min），用甲醇10～20mL分3～5次洗涤离心管和残渣，合并上清液和洗液，减压浓缩至干（温度60～80℃），残渣加甲醇使溶解，转移至5～10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，取续滤液作为供试品溶液；C．标准曲线的绘制：取所得对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪中进行测定，记录对应的色谱图和峰面积；以对照品溶液的浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，计算得线性回归方程；D．结果计算：取所得供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，将所得峰面积带入所述标准曲线的线性回归方程中，即得供试品牛膝中水龙骨素B的含量；高效液相色谱仪内色谱条件满足：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；色谱柱柱温：20～40℃；检测器：UV-PAD检测器；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B；流动相流速：0.8～1.2mL/min；进样量：2～20μL；检测波长：250nm；流动相按下表进行梯度洗脱，具体为：
[0008]优选的，在步骤A中，所述对照品溶液中，水龙骨素B含量为0.0580～1.066mg/mL，
对照品溶液的浓度与对应色谱图中水龙骨素B色谱峰的峰面积具有良好的线性关系。
[0009]优选的，在步骤A中，所述对照品溶液为五份，浓度分别为：0.0580mg/mL、0.1012mg/mL、0.2108mg/mL、0.5020mg/mL及1.066mg/mL。在此对照品浓度范围内，本专利技术提供的方法具有较高的准确性。
[0010]优选的，所述方法的检测限可达到0.75μg/mL。
[0011]采用本技术方案，带来的有益技术效果为：1）在本专利技术中，通过有机溶剂提取有效成分作为供试品溶液，用水龙骨素B对照品进行定位，将供试品溶液与对照品溶液一并进入高效液相色谱仪中进行测定，可实现牛膝中水龙骨素B的定性和定量检测，为后续牛膝中水龙骨素B的定性、定量的研究，为产品质量控制、评价指标提供可靠的检测方法；且本方法操作简便、稳定性高、重复性好及专属性强，RSD值均小于2%，实际检测效果良好；2）本专利技术实用性强，在实际检测过程中，其检测限可达0.75μg/mL，可以判断药材质量的优劣，检测过程简单、快捷。
附图说明
[0012]图1为本专利技术中水龙骨素B对照品溶液的标准曲线及回归方程；图2为本专利技术采用三批次牛膝药材与水龙骨素B对照品溶液（浓度为0.2108mg/mL）的色谱图。
具体实施方式
[0013]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定牛膝中水龙骨素B含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：A．对照品溶液的制备：取对照品水龙骨素B，加甲醇溶解，按浓度呈梯度分布配制至少五份对照品溶液；B．供试品溶液的制备：取供试品牛膝，干燥粉碎后，向牛膝药材粉末中加入水饱和正丁醇，密塞，称定重量，浸泡，超声处理，放冷后以水饱和正丁醇补足重量，摇匀，离心；用甲醇洗涤离心管和残渣，合并上清液和洗液，减压浓缩至干，残渣加甲醇使溶解，转移至容量瓶中，加甲醇至刻度，取续滤液作为供试品溶液；C．标准曲线的绘制：取所得对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪中进行测定，记录对应的色谱图和峰面积；以对照品溶液的浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，计算得线性回归方程；D．结果计算：取所得供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，将所得峰面积带入所述标准曲线的线性回归方程中，即得供试品牛膝中水龙骨素B的含量；高效液相色谱仪内色谱条件满足：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；色谱柱柱温：20～40℃；检测器：UV-PAD检测器；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B；流动相流速：0.8～1.2mL/min；进样量：2～20μL；检测波长：250nm；流动相按下表进行梯度洗脱，具体为：。2.根据权利要求1所述的测定牛膝中水龙骨素B含量的方法，其特征在于，在步骤A中，所述对照品溶液中，水龙骨素B含量为0.0580～1.066mg/mL。3.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋琴，李远志，董艾青，钟钰，赖小红，肖斌，张巨琼，詹强，周婷，刘丁，
申请(专利权)人：成都普思生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：