一种基于瘤内具核梭杆菌预测食管鳞癌转移的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于瘤内具核梭杆菌预测食管鳞癌转移的方法，具体涉及生物医学领域，包括有效检测人食管鳞癌组织内具核梭杆菌，所述具核梭杆菌特异性基因nusG的引物序列特征为：根据具核梭杆菌的nusG基因mRNA序列Gene ID：45633894，基因组序列为NZ_LN831027.1。本发明专利技术通过qPCR检测肿瘤组织内的具核梭杆菌的DNA表达含量，利用预设的cutoff值判定阳性或阴性；其次通过全外显子测序技术检测肿瘤组织的肿瘤突变负荷，利用预设的cutoff值判定高TMB或者低TMB；当F.nucleatum结果为阳性并且高TMB，食管癌更易发生转移；结合两个检测结果建立的预测模型可能成为预测食管鳞癌转移的有力方法。食管鳞癌转移的有力方法。食管鳞癌转移的有力方法。

【技术实现步骤摘要】
一种基于瘤内具核梭杆菌预测食管鳞癌转移的方法


[0001]本专利技术涉及生物医学
，更具体地说，本专利技术涉及一种基于瘤内具核梭杆菌预测食管鳞癌转移的方法。

技术介绍

[0002]食管癌是世界上最主要的上消化道恶性肿瘤。食管癌早期发现较为困难，一经确诊往往为中晚期，并且存在侵袭性强和致死率高等特点，是一种进展迅速并且预后较差的疾病。目前手术仍是食管癌患者获得长期生存的主要手段，但即便是根治性切除，病理检查无淋巴结转移(pNO)的患者术后5年内仍有40％～50％出现转移复发，因此食管癌转移复发是影响患者长期生存的重要原因。现亟待探索更有效的预警食管癌转移复发的手段，从而最终提高食管癌患者总体生存的关键问题。
[0003]具核梭菌作为一种厌氧的革兰氏阴性菌，主要分布于人、动物肠道和口腔粘膜。具核梭菌在口腔中含量最丰富，近年来研究发现该菌与人类疾病的联系越来越多。许多研究表明，具核梭菌与肿瘤的发生相关密切，尤其与结肠癌的发生之间存在相关性。此外，有报告研究它与食管癌的不良预后呈正相关。临床研究提示，较高的具核梭菌含量与食管鳞癌的新辅助化疗的不良反应之间存在正相关。所有的这些研究结果表明：具核梭菌有可能成为提示恶性肿瘤发生和发展的新标志物。
[0004]肿瘤突变负荷(Tumor Mutation Burden，TMB)被定义为所评估基因的外显子编码区每兆碱基中发生置换和插入/缺失突变的总数。肿瘤的突变可能导致产生新的变异蛋白，或者说新抗原，而这些新抗原会被机体免疫系统作为外来物识别并引发细胞毒效应，杀伤肿瘤。肿瘤突变数目越多，就越有可能产生新抗原，从而对免疫治疗有更好的应答。TMB的高低，不仅可以预测免疫治疗的疗效，而且可以精准预测不少靶向药和化疗药的疗效。2019年的大型临床研究中指出1662名接受过PD-1抗体等免疫治疗的癌症患者中，高TMB人群的总生存期明显高于TMB低的人群。在晚期肺癌患者，Hellmann MD发现在EGFR突变的患者，TMB较高的患者，接受靶向治疗，疗效维持时间较短、中位总生存时间较短。在843名接受化疗的肠癌患者中发现TMB高的病人与TMB低的患者相比，总生存时间明显延长。在TMB高的人群中，贝伐联合化疗，相比于爱必妥联合化疗，疗效明显提高，疾病进展的风险下降87％，生存期明显更长。TMB作为生物标志物在预测恶性肿瘤的治疗疗效方面已获得临床数据支撑，在另一方面也充分反映TMB与肿瘤的发展之间紧密相关。
[0005]目前有许多研究报道预测食管鳞癌转移的生物标志物，大多通过单独的蛋白标志物或者血浆中micoRNA进行预测，但由于食管鳞癌转移是受到多个因素所影响，多个指标联合预测可以有效的提高预测效率。因此，多指标联合用于预测食管鳞癌转移的方法已广泛被研究和开发。
[0006]现有技术和方法中未见报道基于瘤内具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)含量和肿瘤突变负荷(TMB)联合预测食管鳞癌(ESCC)转移的方法应用。

技术实现思路

[0007]为了克服现有技术的上述缺陷，本专利技术的实施例提供一种基于瘤内具核梭杆菌预测食管鳞癌转移的方法，本专利技术所要解决的技术问题是：如何将瘤内具核梭杆菌和肿瘤突变负荷进行联合来预测食管鳞癌转移。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于瘤内具核梭杆菌预测食管鳞癌转移的方法，包括有效检测人食管鳞癌组织内具核梭杆菌，所述具核梭杆菌特异性基因nusG的引物序列特征为：根据具核梭杆菌的nusG基因mRNA序列Gene ID：45633894，基因组序列为NZ_LN831027.1；
[0009]nusG正义链引物：5
’-
TGGTGTCATTCTTCCAAAAATATCA-3
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；
[0010]nusG反义链引物：5
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AGATCAAGAAGGACAAGTTGCTGAA-3
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；
[0011]具体预测步骤如下：
[0012]S1：根据该有效的nusG基因序列，通过qPCR技术检测并设定通过熔解曲线评价qPCR结果的可靠性，并取Ct值(达到设定阈值所经历的循环数)，从而检测肿瘤组织内具核梭杆菌的DNA表达；所述的针对人食管鳞癌组织中具核梭杆菌的nusG基因序列，能够有效的检测肿瘤组织内具核梭杆菌的DNA表达，利用qPCR检测食管鳞癌组织中具核梭杆菌的含量；
[0013]S2：利用全外显子测序技术检测食管鳞癌组织的肿瘤突变负荷(TMB)，利用全外显子测序的方法检测肿瘤突变负荷(TMB)，使用Qiagen DNA提取试剂盒从石蜡组织块中提取肿瘤和正常基因组DNA，提取DNA后，对样本分别使用NanoDrop微量核酸蛋白浓度测定仪、qubit荧光定量仪和Agilent BioAnalyzer细胞分析仪进行定量和定性测定；DNA终文库最后在MGISEQ-2000高通量平台上测序；在测序过程中，通过滚环复制(RCR)将ssDNA环与DNA纳米球(DNB)一起生成，以放大荧光信号；将DNB加载到图案化纳米阵列中，并在MGISEQ-2000平台上读取100bp的对端读取，用于后续的数据分析研究；
[0014]S3：联合步骤S1和步骤S2的结果构建预测模型，根据Ct值和TMB值有效地进行食管鳞癌转移情况的预测，基于上述的检测构建预测模型，利用肿瘤中的具核梭杆菌含量和肿瘤突变负荷，两者与食管鳞癌的转移有显著相关性(P＜0.05)。
[0015]在一个优选地实施方式中，所述步骤S1中的检测肿瘤组织内具核梭杆菌的DNA表达方式中：任何Ct值低于或等于37个循环的样本都被认定为阳性；当标本的Ct值大于37时，认为阴性。
[0016]在一个优选地实施方式中，所述步骤S2中设定当TMB值大于或等于120时为高TMB(TMB-H)，TMB值小于120时为低TMB(TMB-L)。
[0017]在一个优选地实施方式中，所述步骤S3中创建的预测食管鳞癌转移模型包括食管鳞癌组织中具核梭杆菌的Ct值和食管鳞癌组织的TMB值。
[0018]本专利技术的技术效果和优点：
[0019]本专利技术通过提供一种能有效预测食管鳞癌转移的方法模型，通过在临床组织标本中检测发现，该方法可以有效的预测食管鳞癌患者的转移，此方法为开发预测食管鳞癌转移的新型生物标志物提供新思路。
附图说明
[0020]图1为本专利技术食管鳞状细胞癌中具核梭杆菌的表达示意图。
[0021]图2为本专利技术的利用全外显子测序技术检测人食管鳞状细胞癌中基因突变和肿瘤突变负荷示意图。
[0022]图3为本专利技术的利用瘤内具核梭杆菌含量联合肿瘤突变负荷预测食管鳞癌转移示意图。
具体实施方式
[0023]下面将结合本专利技术中的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于瘤内具核梭杆菌预测食管鳞癌转移的方法，其特征在于：包括有效检测人食管鳞癌组织内具核梭杆菌，所述具核梭杆菌特异性基因nusG的引物序列特征为：根据具核梭杆菌的nusG基因mRNA序列Gene ID：45633894，基因组序列为NZ_LN831027.1；nusG正义链引物：5
’-
TGGTGTCATTCTTCCAAAAATATCA-3
’
；nusG反义链引物：5
’-
AGATCAAGAAGGACAAGTTGCTGAA-3
’
；具体预测步骤如下：S1：根据该有效的nusG基因序列，通过qPCR技术检测并设定通过熔解曲线评价qPCR结果的可靠性，并取Ct值(达到设定阈值所经历的循环数)，从而检测肿瘤组织内具核梭杆菌的DNA表达；S2：利用全外显子测序...

【专利技术属性】
技术研发人员：石超，李臻，马杰，唐颢，郭永军，
申请(专利权)人：河南省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：