胰腺癌miRNA预后模型的确立及靶向基因的筛选方法技术

胰腺癌miRNA预后模型的确立及靶向基因的筛选方法，包括hsa

【技术实现步骤摘要】
mir-3613和hsa-mir-4772，并鉴定了9个关键基因，包括MMP14、ITGA2、THBS2、 COL1A1、COL3A1、COL11A1、COL6A3、COL12A1和COL5A2。
[0008]另一方面，本专利技术提供胰腺癌miRNA预后模型的确立方法。
[0009]本专利技术利用TCGA和GEO数据库，通过R语言多个安装包对数据进行多步骤分析，与临床信息结合，建立Cox比例风险回归模型寻找预后生物标志物，预测miRNA的靶基因，并利用Cytoscape找出与胰腺癌发生相关的关键基因并且通过KEGG和GO分析预测出这些关键基因的相关分子功能和作用机制，寻找胰腺癌患者的治疗新靶点和预后标志物。
[0010]专利技术详述
[0011]一种胰腺癌miRNA预后模型的确立方法，其包括以下步骤：
[0012]1)检索数据并处理RNA序列数据：从TCGA公共数据中(The Cancer Genome Atlas，https://portal.gdc.cancer.gov/)确认并下载183例PAAD患者的组织样本miRNA-seq 数据(level 3)和相应的临床信息；从GEO公共数据库(Gene Expression Omnibus，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中确认并下载包涵胰腺癌相关组织与正常组织信息的GSE28735的表达谱，其中包含了肿瘤样本(45个)和正常胰腺组织(45个)；
[0013]2)差异miRNAs和基因筛选：采用R语言中的edgeR
[17]，gplots和limma
[18]程序包对TCGA 数据库中获得的胰腺癌与正常组织的miRNA表达矩阵进行标准化、数据拟合及差异分析，并根据|log2FC|>1，P
adj
<0.05的筛选标准筛选显著差异miRNA；利用limma程序包对 GEO芯片GSE28735进行分析差异表达的基因并同样根据|log2FC|>1，P
adj
<0.05的筛选标准筛选显著差异基因，分别绘制差异表达miRNA和基因的火山图；
[0014]3)建立Cox比例风险回归模型：运用Cox比例风险回归模型
[19]分析DEMs与病人生存时间的关联性。Survival package辅助用于对DEMs进行单因素Cox分析和多因素Cox分析。对得出的DEMs分析它们与总体生存率的相关性。在单因素Cox分析中视P<0.05 的miRNA是与病人生存时间为相关性强的表现。多因素Cox分析利用逐步回归法筛选并得到与单因素模型功能相近但miRNA数量更少的，更便于临床研究的预后模型。视多因素模型中P<0.05的miRNA为患者的独立预后因子。
[0015]4)建立预后模型：结合多因素Cox分析结果，根据模型公式Risk Score＝β1
×
Exp(miRNA1)+β2
×
Exp(miRNA2)+...+βn
×
Exp(miRNAn)计算风险分数，再根据风险分数的中位值将病人分为高风险组和低风险组，并绘制风险分数曲线和表达热图，再进行生存分析绘制患者的生存曲线和生存状态图，由此建立起联合miRNA的预后模型。制作该模型的ROC曲线
[20]判断其预测能力，AUC值>0.7则说明该模型具有一定的预测能力。
[0016]5)靶基因预测：分别使用2个miRNA靶基因预测的在线网站TargetScan (http://www.targetscan.org/)，miRDB(http://miRdb.org/)对4个miRNA的靶基因根据碱基序列进行预测。为了减少假阳性，我们对预测出的靶基因取交集。然后，将共同预测的靶基因与显著差异表达基因取交集，得到共有基因。此时，共有基因表示既是 miRNAs的靶基因，又是与胰腺癌相关的显著差异表达基因。
[0017]6)构建互作网络并筛选核心网络：利用在线可视化工具STRING
[23] (http://string-db.org)对共有基因进行分析，获取蛋白-蛋白相互作用数据，选择最小互作分数大于等于0.400构建蛋白-蛋白互作网络(PPI)，并隐藏网络中断开的节点。将蛋白互作数据导入Cytoscape(Version 3.7.1，https://cytoscape.org/)，先使用 cytohubba中的算法MCC
筛选出排名前15的关键基因，再运用Cytoscape中的MolecularComplex Detection(MCODE)插件对15个基因网络系统进行评分，Degree Cut-off＝2， Haircut on，Node Score Cut-off＝0.2,k-core＝2和Max.Depth＝100。计算寻找 MCODE score较高的集簇，从而得到关键基因。接着，将互作网络中基因的logFC值导入Cytoscape得到基因显著差异表达情况。
[0018]7)构建miRNAs-基因-通路可视化网络
[0019]利用Cytoscape将miRNAs与关键基因的关系、共有基因与特殊KEGG通路和GO功能注释的关系进行可视化，呈现出miRNAs与关键基因的调控关系，以及共有基因在P值最小或count值最大的KEGG通路和GO功能注释上的富集情况。
[0020]8)miRNA测序数据、Cox回归模型分析、时间依赖的ROC曲线分析及热图双聚类分析、富集分析、网络分析等均使用R语言软件进行统计分析，所有结果以P<0.05作为差异有统计学意义的标准。
[0021]本专利技术有益效果：
[0022]本专利技术通过对胰腺癌miRNA及基因谱进行生物信息学分析，得到一个与PDAC相关的四miRNA预后模型，包括hsa-mir-424、hsa-mir-126、hsa-mir-3613和hsa-mir-4772，并鉴定了9个关键基因，包括MMP14、ITGA2、THBS2、COL1A1、COL3A1、COL11A1、COL6A3、 COL12A1和COL5A2。其中，hsa-mir-4772、COL12A1和COL5A2需要在PDAC中实验验证。这些miRNAs和基因在成为胰腺癌的治疗靶点和预后标志物方面具有很大潜力。本专利技术的研究可以为未来胰腺癌的诊断和治疗提供新的指导，并可能促进新药的开发。
附图说明
[0023]图1示胰腺癌差异表达的DEMs和DEGs的火山图，(A)绿点表示表达下调的miRNA，红点表示表达上调的miRNA；(B)绿点表示表达下调的基因，红点表示表达上调的基因。横坐标表示样本差异表达倍数的log2转化值，|log2FC|越大表示差异倍数越大。纵坐标表示FDR值的-log10转化值，转化值越大表示差异越显著。
[0024]图2示胰腺癌患者预后模型：(A)从上到下分别是风险分数曲线、生存状态图和热图； (B本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种作为胰腺癌预后的标志物，其特征在于，包括Hsa-mir-424，hsa-mir-126，hsa-mir-3613、hsa-mir-4772、COL12A1或COL5A2。2.权利要求1所述作为胰腺癌预后标志物的确立方法，其包括以下步骤：1)检索数据并处理RNA序列数据：从TCGA公共数据中确认并下载183例PAAD患者的组织样本miRNA-seq数据；从GEO公共数据库中确认并下载包涵胰腺癌相关组织与正常组织信息的GSE28735的表达谱，其中包含了45个肿瘤样本和45个正常胰腺组织；2)差异miRNAs和基因筛选：采用R语言中的edgeR，gplots和limma程序包对TCGA数据库中获得的胰腺癌与正常组织的miRNA表达矩阵进行标准化、数据拟合及差异分析，并根据|log2FC|>1，P
adj
<0.05的筛选标准筛选显著差异miRNA；利用limma程序包对GEO芯片GSE28735进行分析差异表达的基因并同样根据|log2FC|>1，P
adj
<0.05的筛选标准筛选显著差异基因，分别绘制差异表达miRNA和基因的火山图；3)建立Cox比例风险回归模型：运用Cox比例风险回归模型分析DEMs与病人生存时间的关联性；4)建立预后模型：结合多因素Cox分析结果，根据模型公式Risk Score＝β1
×
Exp(miRNA1)+β2
×
Exp(miRNA2)+...+βn
×
Exp(miRNAn)计算风险分数，再根据风险分数的中位值将病人分为高风险组和低风险组，并绘制风险分数曲线和表达热图，再进行生存分析绘制患者的生存曲线和生存状态图，由此建立起联合miRNA的预后模型，制作该模型的ROC曲线判断其预测能力，AUC值>0.7则说明该模型具有一定的预测能力；5)靶基因预测：分别使用2个miRNA靶基因预测的在线网站TargetScan，miRDB对4个miRNA的靶基因根据碱基序列进行预测；6)构建互作网络并筛选核心网络：利用在线可视化工具S...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄遵楠，陈烁玲，曲玥阳，肖桂山，俞天杨，高畅，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：