本发明专利技术公开了一种反式糖苷水解酶及其在糖苷结构改造及修饰中的应用。所述的反式糖苷水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术提出的一种糖水解酶，该酶能够特异性识别皂苷双糖糖单元之间反式的糖苷键，这就给皂苷之间的结构修饰提供多种可能，能够为天然物的结构改造提供技术手段，尤其在皂苷类接有葡萄糖单元的物质修饰中有着巨大优势，也为研究其他天然物的提纯和分离提供新的思路，并且能够产生一定的实际经济意义。此外，通过利用本发明专利技术所述的反式糖苷水解酶对三七皂苷和薯蓣皂苷通过酸解和酶催化进行结构修饰改造，本发明专利技术还建立了制备人参皂苷Rh2和薯蓣皂素的方法，为人参皂苷Rh2和薯蓣皂素的生产提供了新的技术手段。手段。手段。
【技术实现步骤摘要】
一种反式糖苷水解酶及其在糖苷结构改造及修饰中的应用
[0001]本专利技术涉及一种反式糖苷水解酶，还涉及其在糖苷结构改造及修饰中的应用。本专利技术属于生物化学
技术介绍
[0002]随着科学技术的进步，越来越多的天然产物不断的被发现和利用，但一方面往往具有巨大效果的天然物的含量在天然物种的含量偏低，而且几种相似天然化合物还有着相同的结构，因此可以通过化学修饰进行相互之间的转化，从而提升天然化合物分布不均的情况，另一方面部分天然产物其活性不够强、作用特异性低、药代动力学性质不理想、毒副作用大等缺点、不能直接药用，也需要进一步的结构改造和修饰，以提高生物活性和利用率并降低毒副作用。一般可通过化学法、生物转化法、组合化学等方法实现。而生物转化法通过利用生物酶对其进行结构修饰，具备很大的优势，如反应条件温和，无需保护基团保护，选择性高，能够进行一些化学法无法进行的反应，不污染环境等，目前生物转化修饰结构有羟基化、环氧化、甲基化、异构化、酯化、氧化还原、重排和水解等等。
[0003]皂苷是比较常见的天然化合物的存在形式，有着比较复杂的结构，具有广泛的生物活性。其中像人参、三七、绞股蓝等等，就含有大量的皂苷成分，皂苷由皂苷配基与糖、糖醛酸或其他有机酸组成。组成皂苷的糖常见的有D-葡萄糖、L
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鼠李糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、L-木糖。常见的糖醛酸有葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸，这些糖或糖醛酸往往先结合成低聚糖糖链，然后与皂苷配基分子中C3
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OH 相缩合，或由两个糖链分别与皂苷配基分子中两个不同位置上的OH相缩合，皂苷配基分子中的
─
COOH也可能与糖连接，形成酯苷键。往往由于其结合的糖种类和数量等不同，造成其性质和活性的差异，这就给通过化学修饰改造结构提供了较大的空间。其中人参皂苷Rh2和薯蓣皂素就是典型的案例。
[0004]人参作为传统中药，已经有四千年的使用历史了。上世纪90年代初，日本学者发现人参中的一种活性物质一人参皂苷Rg3具有选择性地抑制肿瘤细胞浸润和转移的作用。人参中共有40多种皂苷，但Rg3在新鲜的或自然干燥的人参药材中并不存在，在红参中的含量仅为十万分之三。人参皂苷不仅具有防癌和抗癌的作用，还有提高免疫、保肝、抗疲劳、保护脑神经细胞及抗血栓等药理作用。同时随着对人参研究的深入，日本学者首次从红参中发现了人参皂苷Rh2，这种皂苷是一种次生苷，是鲜人参加工制成红参时，由于某些结构相似的皂苷受热降解后生成的，其在红参中的含量约在十万分之一左右。人参皂苷Rh2在十年前就被发现有抗癌活性，但是由于含量低、提取效率低、成本过高，并没有被过度的开发和利用。近年来临床试验结果陆续被报导出来，人参皂苷Rh2对于抗癌的疗效极为惊人，被视为当今最具潜力的天然抗癌物质，研究证明人参皂苷Rh2对癌细胞有抑制及抗转移的效果，而且效果非常明显。人参皂苷Rh2不但具有抑制所有癌细胞的生长、诱导分化癌细胞和抗转移的功能，同时对人体无毒性。人参皂苷 Rh2使癌细胞核枯萎、死亡的作用，不同于任何放化疗方法及药物。人参皂苷Rh2对人体尚有非常优秀的提升各种免疫机能的作用，对人体健康细胞毫无毒副作用，只专攻击癌细胞。具有极大的开发利用价值。
[0005]三七与人参同为五加科人参属植物，有研究表明，三七茎叶也是人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg3的重要来源。同时三七中含有大量的人参二醇组皂苷，这是制备人参苷Rh2和人参皂苷Rg3的提供良好的原料基础。
[0006]薯蓣皂素是黄姜或川地龙中重要的活性物质，具有雌激素和降低胆固醇的作用，具有抗菌、消炎、止咳等作用，由于其结构与甾体激素的结构极为相似，可作为合成甾体激素药物的主要中间体，是半合成甾族化合物的重要原料。以川地龙或黄姜生药为原料，经水解、提取而得。将薯蓣皂素进行开环、氧化、水解和消除反应，可制得孕甾双烯酮醇。再经肟化、重排和水解，可制得去氢表雄酮。中国化学家黄鸣龙等以薯蓣皂苷元为原料，用七步反应成功地合成了可的松。这些中间体在药物生产中有重要价值。由于薯蓣皂素在原药材中的含量较低，通常是以糖苷的形式存在，其中含量最高的为薯蓣皂苷，但由于薯蓣皂苷自身结构问题，在提取过程中与植物细胞壁黏贴紧密，因此提取效率低。工业上一般采用先发酵(酸解后)形成薯蓣皂素后再提取纯化获得，但这种方法存在着污水量大，有机物含量高，酸性强，色素浓，极难治理，对周围环境造成巨大污染，因此找到一个合适的方法对于其开发利用有着重要意义。
技术实现思路
[0007]本专利技术的目的之一是提供一种糖水解酶，该酶能够将皂苷间糖单元之间的反式糖苷键进行水解，从而改变皂苷的性质，从而解决皂苷间糖单位之间的结构修饰问题。
[0008]为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：
[0009]本专利技术的一种反式糖苷水解酶，是一种水解反式糖苷键的水解酶类，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]进一步的，本专利技术还提出了编码所述的反式糖苷水解酶的核苷酸序列。其中，优选的，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]含有所述的核苷酸序列的表达载体以及含有所述的表达载体的宿主细胞也在本专利技术的保护范围之内。
[0012]更进一步的，本专利技术还提出了一种制备所述的反式糖苷水解酶的方法，包括以下步骤：
[0013](1)反式糖苷水解酶基因的获取
[0014]活化Clostridium stercorarium DSM8532菌种，收集细胞，按照用柱式质粒 DNA小量抽提试剂盒说明说提取DNA，将提取好的DNA做为PCR的模板；以上下游引物进行PCR扩增，获得编码权利要求1所述的反式糖苷水解酶的核苷酸序列，上下游引物分别为：
[0015]上游引物：AGCTGAAGAACGCGGAATGA
[0016]下游引物：AGCATTCGATGCCGAGCTTA
[0017](2)重组质粒的构建及转化
[0018]将步骤(1)获得的编码权利要求1所述的反式糖苷水解酶的核苷酸序列通过XhoI和BamHI酶切位点和载体pET-24C(+)连接，得到含有编码权利要求1 所述的反式糖苷水解酶的核苷酸序列的重组表达载体，命名为pET-24C(+)-gh；
[0019](3)重组酶的表达
[0020]挑起单菌落重组大肠杆菌pET-24C(+)-gh至含抗生素的LB培养基中， 37℃，
220rpm，培养过夜，然后按照5％的接种量，接种到新鲜培养液中，培养至OD600为0.7时，加入诱导剂IPTG，使IPTG在培养基的终浓度为 0.2mmol/L，31℃，220rpm，诱导10个小时，收集菌体10000rpm/20min；
[0021](4)纯化
[0022]将离心得到的菌体，加入6倍体积的0.1M的PBS缓冲液，放置冰水中，超声破碎机破损，所得浑浊液离心，所得上清即为粗酶液；于上清粗酶液中加入絮凝剂，待有沉淀生成后离心去滤渣，用30Kda的超滤膜超滤，以除去小分子蛋白和盐本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种反式糖苷水解酶，其特征在于，所述的反式糖苷水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.编码权利要求1所述的反式糖苷水解酶的核苷酸序列。3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的核苷酸序列。5.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求4所述的表达载体。6.一种制备权利要求1所述的反式糖苷水解酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)反式糖苷水解酶基因的获取活化Clostridium stercorarium DSM8532菌种，收集细胞，按照用柱式质粒DNA小量抽提试剂盒说明说提取DNA，将提取好的DNA作为PCR的模板；以上下游引物进行PCR扩增，获得编码权利要求1所述的反式糖苷水解酶的核苷酸序列，上下游引物分别为：上游引物：AGCTGAAGAACGCGGAATGA下游引物：AGCATTCGATGCCGAGCTTA(2)重组质粒的构建及转化将步骤(1)获得的编码权利要求1所述的反式糖苷水解酶的核苷酸序列通过XhoI和BamHI酶切位点和载体pET-24C(+)连接，得到含有编码权利要求1所述的反式糖苷水解酶的核苷酸序列的重组表达载体，命名为pET-24C(+)-gh；(3)重组酶的表达挑起单菌落重组大肠杆菌pET-24C(+)-gh至含抗生素的LB培养基中，37℃，220rpm，培养过夜，然后按照5％的接种量，接种到新鲜培养液中，培养至OD600为0.7时，加入诱导剂IPTG，使IPTG在培养基的终浓度为0.2mmol/L，31℃，220rpm，诱导10个小时，收集菌体10000rpm/20min；(4)纯化将离心得到的菌体，加入6倍体积的0.1M的PBS缓冲液，放置冰水中，超声破碎机破损，所得浑浊液离心，所得上清即为粗酶液；于上清粗酶液中加入絮凝剂，待有沉淀生成后离心去滤渣，用30Kda的超滤膜超滤，以除去小分子蛋白和...
【专利技术属性】
技术研发人员：张天，朱丽惠，王力，
申请(专利权)人：西安岳达生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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