一株贝莱斯芽孢杆菌05-1205、获取方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一株贝莱斯芽孢杆菌05

【技术实现步骤摘要】
一株贝莱斯芽孢杆菌05-1205、获取方法及其应用


[0001]本专利技术属于微生物应用
，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌05-1205、 获取方法及其应用。

技术介绍

[0002]烟叶烘烤损失是烟叶在烤房中的非正常烘烤而引起的损失，对烟叶生产和烟 农造成重大损失。近年来，烘烤期烟草霉变病已成为我国福建、云南、广西等南 方部分烟区烘烤环节的重要经济损失之一。烘烤期烟草霉变病主要是由于烟叶烘 烤变黄期低温、高湿，烟叶受米根霉(Rhizopus oryzae)侵染引起。
[0003]烘烤期霉变病的防治方法主要包括烘烤设备改进、化学防治和生物防治等。
[0004]烘烤设备改进主要是基于现有烤房通风排湿效果差而进行的改进或建立新 型烤房，例如蔡永占等专利技术了一种防止气流上升式密集烤房烘烤霉烂病的烘烤工 艺(CN111067129A)，例如陈二龙等采用调控密集烤房内气流运动可减轻烟叶霉 变。烘烤工艺或设计的改变对烟草霉变病的防治最为简便、快捷、有效，但成本 较高。
[0005]烟草霉变病的化学防治方面研究较多。汪汉成等研究表明米根霉对氟硅唑和 苯醚甲环唑较为敏感。蔡刘体等在离体叶片法防治烟草霉变病，结果表明嘧菌酯、 啶酰菌胺的防效在以上，但未尚不清楚上述药剂在烤房内的防治效果。苏家恩等 在田间、编烟后施用百菌清、多菌灵、甲霜锰锌3种农药杀菌剂均可有效防治红 花大金元烤中霉变病。苏家恩等对抗微生物制剂在烟草霉变病中的应用进行了研 究，结果表明烘烤期烟草霉变病可采用烤前喷施0.5％脱氢乙酸钠溶液或0.2％纳 他霉素溶液进行预防。王永栋等用二氧化氯、三氯异氰尿酸熏蒸装烟后的烤房， 防效在60～70％。虽然烘烤期烟草霉变病的化学防治效果较好，但因其存在农药 残留和容易产生耐药性等问题，影响烟叶的安全性，其应用受到限制。
[0006]生物防治由于其防效高、专一性强、环境友好，以及不易产生抗药性等优点， 因而受到青睐。
[0007]目前，用于防治烘烤期霉变病的微生物菌剂较少，仅有胶质芽孢杆菌 (Bacillus mucilaginosus)(CN110384247A)、组合微生物菌剂(CN110250209A) 作为生防产品防治烘烤期烟草霉变病的报道。急需研发不同种属的生防菌，为有 效防治烟草烘烤期烟草霉变病提供更多绿色解决方案。

技术实现思路

[0008]本专利技术的第一目的在于提供一株能实现高效防治烘烤期霉变病的贝莱斯芽 孢杆菌05-1205。本专利技术的第二目的在于提供所述贝莱斯芽孢杆菌05-1205的获 取方法。本专利技术的第三目的在于提供所述贝莱斯芽孢杆菌05-1205在烘烤期烟草 霉变病防治中的应用。本专利技术的第四目的在于提供所述贝莱斯芽孢杆菌05-1205 在烟草青枯病、灰霉病、菌核病、靶斑病、根腐病、赤星病中的应用。
[0009]本专利技术的第一目的是这样实现的：一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)， 命名为05-1205，经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的一个株系， 是从烟株组织中分离得到，已于2020年10月5日保藏于中国典型培养物保藏中 心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，中国 典型培养物保藏中心，邮编：430072)，其保藏编号为CCTCC No：M 2020568。
[0010]本专利技术的第二目的是这样实现的：一种所述贝莱斯芽孢杆菌的获取方法，具 体包括以下步骤：
[0011]第一步，分离，包括：
[0012](1)取经检验表面灭菌彻底的烟株组织0.4～0.6g，与灭菌钢珠一并放入2 mL灭菌离心管中，加入400～700μL无菌水，用组织研磨器研磨2.5～3.5min， 频率为20～40r/s；
[0013](2)梯度稀释研磨后的组织液至10-4
，每梯度各取100～300μL匀浆液涂分 离培养基，每处理重复4次；
[0014](3)经暗培养后，后根据菌落形态、颜色等不同挑取单菌落，重新于分离 培养基上划线纯化，挑取划线培养的单菌落移入分离培养基试管斜面保存；
[0015]第二步，筛选，包括：
[0016](1)采用平板对峙法，用直径0.5～0.8cm的打孔器将烟草霉变病菌米根霉 菌丝块贴接于筛选培养基平皿中心，两侧对称划线接种内生细菌，以只接烟草霉 变病菌米根霉菌丝块的处理为对照；
[0017](2)恒温培养，待对照长满全皿时，检查对峙培养结果，记录抑菌带的宽 度，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀 疏和萎缩的现象等来判断分离的内生细菌对病原菌有无拮抗作用，每个处理3 次重复；
[0018]第三步，纯化，包括：
[0019]将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落， 即贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205。
[0020]在第一步分离中：暗培养条件为：25～30℃，时间36～72h；分离培养基成 分以g/L计为：蛋白胨3.0～7.0，牛肉浸膏2～4.0，氯化钠6.0～10.0，琼脂15～18； 其pH为6.8～7.5。
[0021]在第二步筛选中：培养条件为：28℃，时间48～60h；筛选培养基成分以g/L 计为：马铃薯180～220，葡萄糖18～25，琼脂15～18，加蒸馏水至1000mL；其 pH为6.8～7.4。
[0022]在第三步纯化中：培养条件为：25～30℃，时间40～55h；纯化培养基成分 以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0、琼脂15.0～19.0； 其pH为7.0～7.5。
[0023]在第一步分离中：所述的烟株组织为烤烟“红花大金元”的叶片和/或茎。
[0024]本专利技术的第三目的是这样实现的：一种所述贝莱斯芽孢杆菌05-1205在烘烤 期烟草霉变病防治中的应用，具体包括以下步骤：
[0025]步骤a，发酵，包括：
[0026](1)将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205接种到斜面培养基上， 得到发酵种子；
[0027](2)将发酵种子接种到种子培养液中，接种量为3～5v/v％，摇瓶装液量为 25～
35v/v％，得到发酵菌剂；
[0028]步骤b，接种，包括：
[0029]在烟叶编制成杆前或编制后，将发酵菌剂稀释1～4倍，按照每杆烟50～200 mL喷施烟叶叶柄伤口处；
[0030]步骤c，调制，包括：
[0031]烟叶经喷施过发酵菌剂的按正常调制程序烘烤。
[0032]在步骤a发酵中：培养条件为：25～30℃，时间48～72h；斜面培养基成分以 g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0、琼脂15.0～19.0， pH 7.0～7.5；所述的发酵菌剂的有效活菌数为1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205，已在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC No：M 2020568。2.一种权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌05-1205的获取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：第一步，分离，包括：(1)取经检验表面灭菌彻底的烟株组织0.4～0.6g，与灭菌钢珠一并放入2mL灭菌离心管中，加入400～700μL无菌水，用组织研磨器研磨2.5～3.5min，频率为20～40r/s；(2)梯度稀释研磨后的组织液至10-4
，每梯度各取100～300μL匀浆液涂分离培养基，每处理重复4次；(3)经暗培养后，后根据菌落形态、颜色等不同挑取单菌落，重新于分离培养基上划线纯化，挑取划线培养的单菌落移入分离培养基试管斜面保存；第二步，筛选，包括：(1)采用平板对峙法，用直径0.5～0.8cm的打孔器将烟草霉变病菌米根霉菌丝块贴接于筛选培养基平皿中心，两侧对称划线接种内生细菌，以只接烟草霉变病菌米根霉菌丝块的处理为对照；(2)恒温培养，待对照长满全皿时，检查对峙培养结果，记录抑菌带的宽度，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象等来判断分离的内生细菌对病原菌有无拮抗作用，每个处理3次重复；第三步，纯化，包括：将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，即贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)05-1205。3.如权利要求2所述的获取方法，其特征在于，在第一步分离中：暗培养条件为：25～30℃，时间36～72h；分离培养基成分以g/L计为：蛋白胨3.0～7.0，牛肉浸膏2～4.0，氯化钠6.0～10.0，琼脂15～18；其pH为6.8～7.5。4.如权利要求2所述的获取方法，其特征在于，在第二步筛选中：培养条件为：28℃，时间48～60h；筛选培养基成分以g/L计为：马铃薯180～220，葡萄糖18～25，琼脂15～18，加蒸馏水至1000mL；其pH为6.8～7.4。5.如权利要求2所述的获取方法，其特征在于，在第三步纯化中：培养条件为：25～30℃，时间40～55h；纯化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0、琼脂15.0～19.0；其pH为7.0～7.5。6.如权利要求2至5任意一项所述的获取方法，其特征在于，在第一步分离中：所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢灿华，夏振远，晋艳，姜宁，盖晓彤，马俊红，雷丽萍，苏家恩，鲁子贤，高朝阳，蔡永占，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：