一株表达脂肪酶的地衣芽孢杆菌及其发酵产酶方法技术

一株表达脂肪酶的地衣芽孢杆菌及其发酵产酶方法，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.20140。地衣芽孢杆菌发酵生产脂肪酶的发酵液酶活高达到32000U/mL；所产脂肪酶最适作用温度范围为30℃

【技术实现步骤摘要】
一株表达脂肪酶的地衣芽孢杆菌及其发酵产酶方法


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及一种表达脂肪酶的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）及其发酵产酶方法。

技术介绍

[0002]脂肪酶（1ipase，E.C.3.1.1.3）也称为脂肪分解、甘油酯水解酶或三酰基甘油酰基水解酶，可以催化甘油三酸酯的水解使其在油-水界面中转化为甘油和脂肪酸，具有在水性和非水性介质中逆转该反应的特性和对映选择性。脂肪酶已成为领先的生物催化剂之一，可应用于食品、医药、洗涤剂、纺织、生物柴油、造纸、皮革、化妆品和环境保护等多个工业领域。
[0003]脂肪酶主要来源于动物、植物和微生物。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用pH、温度范围以及底物专一性，许多微生物被认为是分泌型胞外脂肪酶的潜在生产者而获得不断地工业关注，包括细菌，酵母和真菌。真菌类适用于固态发酵中培养，而细菌和酵母菌则应在深层发酵中培养。微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，并且在理论研究方面也具有重要的意义。
[0004]脂肪酶的制备方法有提取法、化学合成法和微生物发酵法。提取法主要是针对动植物体，其缺点是资源有限、工艺复杂、产量低；化学合成成本太高；微生物发酵法的应用前景要远远大于提取法和化学合成法，它不受环境影响，资源丰富，产酶周期短，产物较单纯且成本低，生产上易于管理。商业化脂肪酶主要来源于各种细菌、酵母和真菌等微生物的发酵产物，有些霉菌可通过固态发酵及液体深层发酵两种方法进行发酵。
[0005]目前工业合成的脂肪酶其种类有限、生产效率较低且生产成本高、最适反应温度和pH范围小、受酶活和适用条件的制约，故不能满足工业生产的需求，筛选一株高产脂肪酶的地衣芽孢杆菌菌株势在必行，其胞外脂肪酶活力高且具有广泛适用范围，生产成本低廉，对大规模拓宽脂肪酶应用领域具有重大意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提出一株表达脂肪酶的地衣芽孢杆菌及其发酵产酶方法与胞外脂肪酶，提高发酵过程中地衣芽孢杆菌的脂肪酶产量和活力，并且显著拓宽了脂肪酶的最适反应条件。
[0007]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的。
[0008]表达脂肪酶的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）NCU CS-5，已于2020年6月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101），其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.20140。
[0009]所述的地衣芽孢杆菌株NCU CS-5在营养肉汤琼脂培养基上培养24h后，菌落呈圆
形扁平且边缘不整齐，白色表面粗糙褶皱，不透明，粘着、直径1.5～3.0mm。革兰氏染色为阳性，在显微镜下观察细胞形态和排列呈长杆状，直径0.6～0.9μm左右，产芽孢（椭圆状芽孢中生）、有鞭毛、无荚膜。
[0010]本专利技术的另一目的在于提供上述地衣芽孢杆菌NCU CS-5的发酵产酶方法。
[0011]（1）一级种子液的制备：挑取一环地衣芽孢杆菌株NCU CS-5接种于营养肉汤琼脂平板培养基，37℃下恒温培养36h。
[0012]（2）二级种子液的制备：从琼脂平板中取一环一级种子接入种子培养基中，37℃和200r/min条件下培养36h，得二级种子液。
[0013]（3）高密度发酵培养：将二级种子液中的菌体按照湿重接种量40%（w/v）的比例接入发酵罐培养基中，35～40℃，转速600r/min，设置通风速率为1.5L/min，采用分批发酵在发酵全程利用补料培养基使发酵液维持pH7.5，发酵周期为156h，最终得到的发酵液中脂肪酶酶活高达32000U/mL，通过纯化与精制方法获得成品液体脂肪酶。
[0014]所述的营养肉汤琼脂平板培养基(g/L)：琼脂15.0，蛋白胨10.0，牛肉浸粉3.0，氯化钠5.0，pH7.2
±
0.2，121℃灭菌20min。
[0015]所述的种子培养基(g/L)：葡萄糖40.0，蛋白胨5.0，牛肉浸粉5.0，氯化钠0.5，硫酸镁0.5，磷酸氢二钠0.5，pH 7.0，121℃灭菌20min。
[0016]所述的种子罐培养基(g/L)：葡萄糖80.0，酵母粉20.0，玉米汁5.0，氯化钠1.0，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾2.0，pH 7.0，121℃灭菌30min。
[0017]所述的发酵罐培养基(g/L)：葡萄糖200.0，蛋白胨10.0，酵母粉5.0，氯化钠1.5，硫酸镁0.5，橄榄油20.0，磷酸氢二钾0.3，pH 7.0，121℃灭菌30min。
[0018]所述的补料培养基(g/L)：葡萄糖500.0，氯化钠5.5，磷酸二氢钾 5.0，玉米汁7.0，橄榄油40.0，pH 7.0，121℃灭菌30min。
[0019]本专利技术还提供一种上述地衣芽孢杆菌株NCU CS-5发酵所产的脂肪酶，其脂肪酶的最适温度范围为30℃-40℃、最适pH范围为8.5-9.5、在4℃下孵育48h后其相对酶活为60％。
[0020]所述脂肪酶的纯化与精制方法如下。
[0021]（1）向最终得到的发酵液中加入5％（w/v）硅藻土助滤剂，压滤得到澄清压滤酶液。
[0022]（2）用截留分子量30000的超滤膜对上述澄清压滤酶液进行超滤浓缩，分离得到脂肪酶浓缩液。
[0023]（3）在上述脂肪酶浓缩液中加入20％ (w/v)的甘油、0.5％ (w/v)的防腐剂：山梨酸钾：苯甲酸钠=1:1（w/w）pH8.5，然后进行膜式无菌过滤系统过滤除菌，即得到最终产品液体脂肪酶。
[0024]本专利技术的有益效果是：筛选出一株高产脂肪酶的地衣芽孢杆菌株NCU CS-5，并对其发酵过程进行补料条件优化使所产脂肪酶酶活达到32000U/mL左右。地衣芽孢杆菌株NCU CS-5的发酵培养基成分均来源于成本较低的原料，在减少发酵成本的同时提高发酵产能和生产效率，对工业化生产具有极大帮助。地衣芽孢杆菌株NCU CS-5发酵得到的脂肪酶最适温度范围为30℃-40℃、最适pH范围为8.5-9.5、在4℃下孵育48h后其相对酶活为60％，具有显著的耐低温性和耐碱性，可广泛应用于工业生产中，显著地拓展了脂肪酶的工业应用范围并提高了其应用价值。
附图说明
[0025]图1为不同温度下的相对酶活。
[0026]图2为不同pH下的相对酶活。
[0027]图3为4℃下保温48h后的相对酶活。
具体实施方式
[0028]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。
[0029]实施例1。地衣芽孢杆菌NCU CS-5的筛选方法。
[0030]（一）实验材料准备。
[0031]1、分离源取自实验室采集和脱壳后在储藏过程中部分变质的樟树籽。
[0032]2、培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株表达脂肪酶的地衣芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.20140。2.权利要求1所述表达脂肪酶的地衣芽孢杆菌发酵产酶方法，其特征是包括以下步骤：（1）一级种子液的制备：挑取一环地衣芽孢杆菌株接种于营养肉汤琼脂平板培养基，37℃下恒温培养36h；（2）二级种子液的制备：从琼脂平板中取一环一级种子接入种子培养基中，37℃和200r/min条件下培养36h，得二级种子液；（3）高密度发酵培养：将二级种子液中的菌体按照湿重接种量40%（w/v）的比例接入发酵罐培养基中，35～40℃，转速600r/min，设置通风速率为1.5L/min，采...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾哲灵，赵钧馨，曾诚，马毛毛，余平，万冬满，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：