一种毛囊微阵列共培养系统及在治疗病理性脱发药物中的应用技术方案

一种毛囊微阵列共培养系统及在治疗病理性脱发中的应用，包括毛囊干细胞悬液和待修复受损毛囊。本发明专利技术提出了利用异体正常人毛囊干细胞联合药物分子营造适于毛囊修复微环境的新思路，并提出了利用软琼脂将毛囊干细胞和受损毛囊进行体外3D共培养的毛囊微阵列共培养系统。系统。系统。

【技术实现步骤摘要】
一种毛囊微阵列共培养系统及在治疗病理性脱发药物中的应用


[0001]本专利技术涉及基因工程技术及生物药物领域，尤其涉及一种毛囊微阵列共培养系统及在治疗病理性脱发中的应用。

技术介绍

[0002]毛囊干细胞(hair follicle stem cells，HFSCs)是存在于毛囊外根鞘隆突部中的一群能自我更新和增殖的多潜能干细胞，能分化成毛囊、皮脂腺、表皮，对毛发的再生起着重要的作用。研究表明，人毛囊干细胞表达多种细胞表面分子标记物如CD200、角蛋白15(keratin 15，K15)、角蛋白19(keratin 19，K19)、整合素α6、整合素β1、Nestin等，而不表达内皮细胞标志分子CD31；此外，也不表达小鼠毛囊干细胞的标记分子CD34。利用这些阳性和阴性标记分子，研究者们可以更好的分离纯化毛囊干细胞，这加快了毛囊干细胞的研究进程。与胚胎干细胞及其它成体干细胞相比，毛囊干细胞具有来源丰富、取材方便、对机体无损害、无伦理问题等优点。文献报道过，通过移植毛囊干细胞使裸鼠长出毛发，证明移植健康毛囊干细胞具有修复受损毛囊的潜力。
[0003]不过，毛囊干细胞在促进毛发再生方面可能有一套复杂的机制。Garza 等发现患者脱发组织和未发生脱发的头皮组织毛囊干细胞的数量没有显著差异，但是脱发头皮组织中的毛囊干细胞不能产生让毛发生长的源细胞，这表明脱发头皮组织中的毛囊干细胞可能产生了缺陷。Matsumura等的研究则表明毛囊干细胞累积的DNA损伤会阻止其发挥作用。还有研究表明毛囊干细胞的增殖分化受其周围微环境影响；周围毛囊的信号会影响毛囊干细胞的活性，从而刺激毛囊生长。因此，对毛囊干细胞促进毛囊再生的作用机制进行研究，有助于推进其临床应用。此外，尽管毛囊干细胞有明确的细胞表面标记分子，但其分离培养的操作却比较复杂、时间周期也较长。因此，倘若能够应用异体来源的毛囊干细胞作为供体，这必将大大扩大毛囊干细胞的应用范围。鉴于此，本专利技术研究毛囊干细胞促进毛发再生的相关机制，探索利用异体毛囊干细胞治疗病理性脱发的可行性。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是研究毛囊干细胞促进毛发再生的相关机制，探索利用异体毛囊干细胞治疗病理性脱发的可行性。
[0005]一种毛囊微阵列共培养系统，包括毛囊干细胞悬液和待修复受损毛囊。
[0006]进一步，所述毛囊干细胞悬液的培养方法包括以下步骤：
[0007](1)取健康毛囊以青-链霉素的PBS液反复冲洗；
[0008](2)在解剖显微镜下采用显微手术剪剪下毛囊外根鞘隆突部，放到培养皿中；加入毛囊干细胞培养基，37℃、5％CO2孵箱培养；
[0009](3)次日补加等量培养基1.5mL，在倒置显微镜下观察毛囊外根鞘隆突部有无梭形生长的细胞爬出，待细胞融合达80％后传代培养；
[0010](4)将上述毛囊干细胞消化，用毛囊干细胞培养液制成1.0
×
105个/mL 的毛囊干细胞悬液，计数。
[0011](5)按1:1混合1.2％的琼脂糖和DMEM/F12培养基后，取2ml混合液注入35cm2培养皿中，待冷却凝固后，置入培养箱中备用。
[0012](6)按1:1比例将0.7％琼脂糖和毛囊干细胞培养基在无菌试管中混合后，在向管中加入1/10体积的毛囊干细胞悬液，充分混匀，注入培养基I的培养皿中，加入量等于培养基I。
[0013](7)2天一次更换培养基，总共培养10天，
[0014]进一步，所述毛囊干细胞培养液含10％FBS、100U/mL青链霉素双抗、 2ng/ml bFGF的DMEM/F12。
[0015]进一步，所述培养基I，按1:1混合1.2％的琼脂糖和DMEM/F12培养基后，取2ml混合液注入35cm2培养皿中，待冷却凝固后，置入培养箱中备用。
[0016]进一步，所述毛囊干细胞消化的消化液包含质量百分含量为0.1％的胰酶和0.008％的EDTA的磷酸缓冲液。
[0017]进一步，所述健康毛囊取自脑后枕部，
[0018]进一步，所述消化条件为37℃消化3-5分钟。
[0019]进一步，将所述待修复受损毛囊以以青-链霉素的PBS液反复冲洗，插入固化毛囊干细胞悬液上层琼脂糖，置入培养箱中进行3D共培养，形成毛囊微阵列共培养系统。
[0020]一种毛囊微阵列共培养系统在治疗病理性脱发中的应用，将脱发区的受损毛囊，植入上述的毛囊微阵列共培养系统进行修复培养，将修复成功的毛囊植于脱发区。
[0021]进一步，将修复成功的毛囊植于脱发区，并给与口服药物。
[0022]进一步，所述口服药物为胸腺肽。
[0023]本专利技术的有益效果：本专利技术提出了利用异体正常人毛囊干细胞联合药物分子营造适于毛囊修复微环境的新思路，并提出了利用软琼脂将毛囊干细胞和受损毛囊进行体外3D共培养的毛囊微阵列共培养系统。
附图说明
[0024]图1注射5w后各组裸鼠皮肤HE；
[0025]图2皮下注射HFSC后毛发生长状态。
[0026]具体实施方式
[0027]为了阐述本专利技术的技术方案和技术目的，下面具体实施方式对本专利技术做进一步介绍。
[0028]1、动物试验
[0029]1.1建立雄激素性脱发大鼠模型：6周龄雄性SD大鼠，先以脱毛膏脱去背部毛发，再1mL(1.5mg)甲睾酮(取甲睾酮片60片，每片0.5mg，碾成细粉，配蒸馏水20m L，搅匀)及0.2mL猪油灌胃，每天1次，连续灌胃60天，制作雄激素性脱发大鼠模型。
[0030]1.2动物分组及毛囊干细胞移植：将造模成功的SD大鼠随机分为对照组、毛囊干细
胞组、毛囊干细胞+药物组，每组6只。消化收集毛囊干细胞后，以无菌生理盐水洗涤两次，再以无菌生理盐水重悬制成1.0
×
105个/mL的细胞悬液。毛囊干细胞组取细胞悬液于大鼠背部脱毛部位皮下多点注射，每个点100μL，共注射500μL；毛囊干细胞每2天注射1次，共进行3次注射。对照组则以同样方式注射同等体积的生理盐水。毛囊干细胞+药物组除进行毛囊干细胞移植外，另外给予腹腔注射适量药物，每周2次。每周2次。
[0031]1.3每周观察大鼠脱毛部位毛发生长情况并作好记录，8周后处死大鼠，取背部脱毛部位皮肤组织制成石蜡组织标本。 对照组实验组1实验组2实验组3实验组4实验组5实验组60w00000001w00000002w00220123w02323234w02332335w0233333
[0032]1.4毛囊HE染色：将皮肤组织蜡块切成厚度为5μm的石蜡切片后，二甲苯脱蜡和梯度酒精水化；自来水清洗3次后，用Harris苏木素染色液浸泡染色 3-5min，自来水清洗；1％盐酸酒精分化3-5s，自来水清洗；0.2％氨水溶液浸泡1 min返蓝，自来水清洗；以伊红染色液浸泡染色30s；95％酒精、无水乙醇脱水，二甲苯透明、中性树胶封片；显微镜下观察并拍照，如图1。比较实验组与对照组毛囊本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种毛囊微阵列共培养系统，其特征在于：包括毛囊干细胞悬液和待修复受损毛囊。2.根据权利要求1所述的一种毛囊微阵列共培养系统，其特征在于：所述毛囊干细胞悬液的培养方法包括以下步骤：(1)取健康毛囊以青-链霉素的PBS溶液反复冲洗；(2)在解剖显微镜下采用显微手术剪剪下毛囊外根鞘隆突部，放到培养皿中；加入毛囊干细胞培养基，37℃、5％CO2孵箱培养；(3)次日补加等量培养基1.5mL，在倒置显微镜下观察毛囊外根鞘隆突部有无梭形生长的细胞爬出，待细胞融合达80％后传代培养；(4)将上述毛囊干细胞消化，用毛囊干细胞培养液制成1.0
×
105个/mL的毛囊干细胞悬液，计数；(5)按质量比1:1混合1.2％的琼脂糖和DMEM/F12培养基后，取2ml混合液注入35cm2培养皿中，待冷却凝固后，置入培养箱中备用；(6)按1:1比例将0.7％琼脂糖和毛囊干细胞培养基在无菌试管中混合后，在向管中加入1/10体积的毛囊干细胞悬液，充分混匀，注入培养基I的培养皿中，加入量等于培养基I；(7)2天一次更换培养基，总共培养10天。3.根据权利要求2所述的一种毛囊微阵列共培养系统，其特征在于，所述毛囊干细胞培养液含10％FBS、100U/mL青链霉素双抗、2ng/ml bFGF的DMEM/F12。4.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：周翔，李胜华，
申请(专利权)人：华科同济干细胞基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：