一种测定百白破疫苗颗粒大小和分布的方法技术

本发明专利技术具体涉及一种测定百白破疫苗颗粒大小和分布的方法，用于百白破疫苗颗粒一致性与稳定性评价，属于疫苗质量评价领域的应用。本发明专利技术采用激光粒度仪测定疫苗颗粒的大小和分布，该方法覆盖疫苗颗粒大小全范围，数据完整性好，适用于百白破疫苗颗粒的大小和分布测定。方法的主要内容为分别使用高浓度池和批式池，使用激光粒度仪进行检测。使用Wing SALD II软件采集散射衍射光光强数据，根据光强数据换算得出颗粒粒径大小和分布数据。本方法解决了《中国药典》、《美国药典》和《欧洲药典》指定方法不能覆盖疫苗颗粒全范围的问题。本方法重复性好、可操作性强，易于实现标准化和产业化，可用于百白破疫苗颗粒的一致性和稳定性评价，对百白破疫苗的质量评价具有指导意义。百白破疫苗的质量评价具有指导意义。百白破疫苗的质量评价具有指导意义。

【技术实现步骤摘要】
一种测定百白破疫苗颗粒大小和分布的方法


[0001]本专利技术具体涉及一种测定百白破疫苗颗粒大小和分布的方法，用于百白破疫苗颗粒一致性与稳定性评价，属于疫苗质量评价领域的应用。

技术介绍

[0002]百白破疫苗颗粒大小和分布的测定
[0003]百白破疫苗是百日咳、白喉、破伤风三合一疫苗，用以预防由百日咳杆菌、白喉杆菌和破伤风杆菌感染引起的疾病。其主要接种对象为3月龄至6周岁的儿童，是中国婴幼儿计划免疫的重要组成部分。世界卫生组织(WHO)2018年统计数据显示，百白破已成为全球覆盖度最为广泛的疫苗品种。
[0004]百白破疫苗在生产工艺上需要添加佐剂来吸附抗原蛋白(即疫苗活性蛋白)，抗原蛋白与佐剂结合后形成疫苗颗粒。疫苗颗粒的大小和分布变化会影响疫苗有效性和安全性，严重时会导致过敏、发热、红肿等不良反应。针对疫苗颗粒的大小和分布的检测及评价，尚无明确的国标方法和限量要求。百白破抗原蛋白颗粒一般在几十纳米至几百纳米之间，佐剂颗粒在几微米到几十微米之间。抗原蛋白与佐剂结合后的百白破疫苗颗粒通常在零点几微米至几十微米之间，属于亚微米(0.1μm-1μm)、亚可见区(1μm-100μm)颗粒。对于微米级以上颗粒的大小及分布检测，药典指定注射剂中不溶微粒检测方法，也是常用的方法，为光阻法和光学显微镜法。例如，《中国药典》、《美国药典》和《欧洲药典》对注射剂中大于10μm和25μm的不溶微粒做出了限量要求，指定的检测方法为光阻法和光学显微镜法。这些方法具有较长的历史，其局限性尤其是在疫苗检测中的局限也多有报道。例如，光阻法在疫苗检测中存在如下局限：1、百白破疫苗为半透明-浑浊液体，而光阻法不适用于半透明样品的测定，且百白破疫苗颗粒浓度高，测定过程中容易堵塞仪器；2、用样体积大，药典指定一次测定用样25mL，而一支成品疫苗仅0.5mL；3、测定对象主要为大于1μm的颗粒，其测量结果不能覆盖疫苗颗粒全范围。显微镜法存如下局限：1、要求操作人员有一定的目测经验，操作效率较低，结果受人为因素影响；2、主要测定对象为1μm以上的颗粒，同样测定结果不能覆盖疫苗颗粒全范围。对1μm以下颗粒大小和分布检测常用方法有尺寸排阻色谱法、超速离心分析和场流分离法等方法，同样存在的突出问题是单一检测方法不能覆盖疫苗颗粒全范围，且多种方法测量结果由于测定原理不同，无法完美拼接比对。因此，急需一种新型检测技术来填补以上方法的不足，一次检测覆盖疫苗颗粒大小和分布的全范围。
[0005]疫苗颗粒一致性评价
[0006]根据世界卫生组织及国家食品药品监督管理局的相关规定，新疫苗在申请生产批件之前，需开展批次一致性研究，以验证疫苗生产过程的一致性。影响疫苗批次一致性因素很多，如疫苗活性成分含量，疫苗颗粒分布等。疫苗颗粒大小和分布会随着生产、保存和运输条件的改变而变化，如保存时间的长短、保存及运输过程中的温度变化、运输过程中的机械震动等都会影响疫苗颗粒的大小，从而在不同程度上影响疫苗的批次的一致性，严重时影响疫苗的安全性和有效性。传统的疫苗批次一致性研究主要通过临床试验来评价疫苗的
免疫原性和安全性，由于上述疫苗颗粒测定方法的局限性，对疫苗颗粒大小和分布的批次一致性研究甚少。因此，急需发展一种可用于疫苗颗粒大小和分布的批次一致性研究方法。
[0007]疫苗颗粒稳定性评价
[0008]疫苗颗粒的大小和分布不仅会影响疫苗的有效性和安全性，还会影响疫苗的稳定性。疫苗稳定性研究用于确定疫苗的保存条件及有效期限，证明在有效期内疫苗的有效性和安全性。为保证疫苗质量，世界卫生组织发布《WHO疫苗稳定性评价指南》，中国药典也明确要求开展疫苗及需要放置的中间产物，在生产、运输和贮存过程中可能暴露的所有条件下的稳定性研究。疫苗稳定性主要评估标准通常是看其效力能否保持合格，也可结合理化分析和生物学方法进行稳定性评价。目前稳定性评价研究多集中在效力评估，缺乏对疫苗颗粒的大小和分布的理化指标稳定性研究。疫苗储存和运输过程中温度变化，以及运输过程中的机械震动都会影响疫苗颗粒大小和分布，从而影响疫苗的稳定性。因此，有必要发展一种可用于疫苗颗粒大小和分布的稳定性研究的方法。

技术实现思路

[0009]本专利技术目的是克服现有疫苗颗粒检测技术的不足，并对以往疫苗的质量研究进行补充。使用岛津激光粒度仪测定了百白破疫苗抗原蛋白、铝佐剂和疫苗的颗粒大小及分布，从而评价百白破疫苗颗粒的一致性和稳定性。
[0010]为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
[0011]使用岛津激光粒度仪(SALD-7500nano)测定百白破疫苗颗粒大小和分布，具体方法如下所述。
[0012]1、仪器及其参数
[0013]仪器参数见表1。
[0014]表1仪器及参数详表
[0015][0016][0017]2、样品前处理
[0018]抗原蛋白直接测定，铝佐剂用超纯水稀释500倍后待测；百白破疫苗样品轻微振荡混匀后，取0.1mL用超纯水定容至1mL和5mL，即稀释10倍和50倍后待测。
[0019]3、样品测定
[0020]取前处理后样品于高浓度池/批式池中，使用激光粒度仪进行检测，使用Wing SALDⅡ软件采集散射衍射光光强数据，软件根据米氏和费氏定理将光强数据换算得出颗粒粒径大小和分布数据，具体检测条件为：
[0021][0022]4、术语解释
[0023]颗粒分布指不同大小颗粒占颗粒总数的体积百分含量；
[0024]D10指颗粒累积体积百分含量达到10％时所对应的粒径值；
[0025]D50指颗粒累积体积百分含量达到50％时所对应的粒径值；
[0026]D90指颗粒累积体积百分含量达到90％时所对应的粒径值。
[0027]本专利技术所述的一种测定百白破疫苗颗粒大小和分布的方法，可以用于佐剂对抗原蛋白的吸咐效果初步评价；其具体步骤为：采用本专利技术所述的测定方法分别测出百白破抗原蛋白、铝佐剂和疫苗颗粒大小和分布，若疫苗颗粒中没有与抗原蛋白大小接近的颗粒，则表明抗原蛋白与佐剂吸咐完全；若疫苗颗粒远大于佐剂颗粒，则表明铝佐剂吸咐蛋白后，颗粒与颗粒之前存在不同程度的聚集。
[0028]本专利技术所述的一种测定百白破疫苗颗粒大小和分布的方法，可以用于百白破疫苗颗粒批间一致性评价；其具体步骤为：采用本专利技术所述的测定方法分别测定不同厂家不同批次百白破疫苗颗粒的大小和分布，根据测定结果，进而评价百白破疫苗颗粒大小批间一致性，其评价标准为根据疫苗颗粒分布和D50的差异来评价疫苗颗粒批间一致性；若不同批次疫苗颗粒分布差异小，且D50的变化小，表明颗粒大小和分布的批间一致性较好。
[0029]本专利技术所述的一种测定百白破疫苗颗粒大小和分布的方法，可以用于百白破疫苗颗粒批内一致性评价；其具体步骤为：采用本专利技术所述的测定方法分别测定同一厂家同一批次不同分装瓶中百白破疫苗颗粒的大小和分布，评价分装对百白破疫苗颗粒大小及分布的影响；若疫苗颗粒分布重现性好，D50变化小，则批内一致性良好；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定百白破疫苗颗粒大小和分布的方法，其特征在于，采用激光粒度仪对样品进行检测，其检测条件为：2.根据权利要求1所述的一种测定百白破疫苗颗粒大小和分布的方法，其特征在于，其具体步骤为：(1)样品前处理抗原蛋白直接测定，铝佐剂稀释500倍后待测；百白破疫苗样品轻微振荡混匀后，稀释10倍和50倍后待测；(2)样品测定取前处理后样品于高浓度池/批式池中，使用激光...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄小艳，李喆，马霄，李月琪，宋晓红，龙珍，黄涛宏，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：