一种小分子抑制剂在制备抗肿瘤药物方面的应用制造技术

本申请属于生物医药领域，具体涉及一种分化抑制因子2，即ID2抑制剂及其在制备脑胶质瘤药物方面应用的专利申请事宜。本研究通过计算机药效团虚拟筛选技术及CCK

【技术实现步骤摘要】
一种小分子抑制剂在制备抗肿瘤药物方面的应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体地说，本专利技术涉及一种分化抑制因子2即ID2抑制剂及其在制备胶质瘤药物方面的应用。

技术介绍

[0002]恶性胶质瘤，以神经胶质母细胞瘤(GBM)为代表，缺乏有效的治疗手段，目前治疗方案还是以传统手术和放化疗为主，副作用极大。肿瘤的复发率超过90％，病人的中位生存期仅一年左右。由于胶质瘤有丰富的新生血管支持其呈浸润性生长，手术治疗的效果并不理想。因此，寻找胶质瘤进展中发挥关键作用的潜在靶点具有重要的临床实际意义。
[0003]目前FDA批准的用于恶性胶质瘤治疗的化疗药物有替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)和贝伐单抗(安维汀)等。作为GBM的一线化疗药，TMZ耐药是制约胶质瘤化疗效果并导致治疗失败的重要因素。
[0004]哺乳动物中普遍表达的分化抑制因子(ID蛋白)在组织中协同调节基因表达、细胞谱系定位和细胞分化。目前已在哺乳动物中发现四种ID蛋白(ID1～4)，它们的分子量小，半衰期短。其中，ID2(inhibitor of DNA binding 2)由两个高度保守性的α螺旋和连接两螺旋的一段保守性差的袢环结构组成，是一段长为1.3kb的mRNA编码的含有134个氨基酸的小分子蛋白。与其他ID蛋白一样，ID2通过与bHLH转录因子结合形成异二聚体发挥作用并保护它们免受快速降解。越来越多的研究表明，与正常胶质细胞相比，ID2在多种胶质瘤细胞中的mRNA和蛋白质表达水平均有不同程度升高的现象，这提示ID2可能在胶质瘤的发生发展中发挥重要作用。研究发现，ID2蛋白在神经源性肿瘤细胞和内皮细胞中异常表达，刺激恶性细胞大量增殖、癌前表型和肿瘤新生血管的形成等关键过程，并阐明了其部分作用机制，提示ID2在胶质瘤的发生发展中起着重要作用。此外，ID2表达量的高低在一定程度上还与胶质瘤患者的预后有重要关系。
[0005]长期以来，传统抗癌药物大都是属于细胞毒类药物。尽管传统抗癌药物具有一定的临床疗效，但由于它们无法区分肿瘤细胞和正常机体细胞，会引起严重毒副反应。近年来，随着对癌症发生分子机制研究的不断深入，开始了针对细胞受体、关键基因和调控分子等为靶点的个体化治疗，即分子靶向治疗。基于药效团虚拟筛选技术，我们获得了多种与ID2蛋白有较高亲和力的化合物，并选择其中具有较佳抑制活性的化合物，评估了其体内外的抗胶质瘤活性，相关结果表明，该化合物具有良好的抑制胶质瘤生长的效用，具有潜在的应用价值。

技术实现思路

[0006]本申请的目的在于提供一种针对ID2分子的新型小分子抑制剂及其在制备脑胶质瘤药物方面的应用。
[0007]本专利技术所用的ID2抑制剂，分子量为：392.84；性状：灰白色粉末；溶于二甲基亚砜(DMSO)；4度密封避光保存，其化学结构如下：
[0008][0009]本项目利用计算机软件LigandScout基于配体的药效团建模技术，开发了针对ID2抑制剂的特定药效团模型。使用这些模型作为虚拟筛选过滤器，发现了16种新型ID2抑制剂。我们在体外利用CCK-8细胞毒性实验筛选出抑制效果和溶解度最好的小分子化合物，其编号为AK-778/43420895。表面等离子共振技术(SPR)检测结果显示本抑制剂与ID2蛋白有高度亲和力。
[0010]所述ID2抑制剂在制备抗脑胶质瘤药物方面的应用，本抑制剂能靶向与ID2高度亲和力有效结合后，通过抑制ID2的表达，进而抑制后者的促胶质瘤恶性发展作用，达到其抑制肿瘤生长，治疗或预防胶质瘤的作用。
[0011]所述ID2蛋白，是螺旋环螺旋(HLH)转录因子家族的一员，不同于碱性螺旋环螺旋转录因子(bHLH)，ID蛋白缺乏与DNA结合所必需的碱性基序，能与bHLH转录因子结合形成异二聚体从而抑制后者的转录活性，对细胞增殖起着正向调节作用。近年来ID2在胶质瘤和其他多种肿瘤中广泛表达的特点使之成为探索胶质瘤发展的新研究方向。通过对ID2的不断深入研究，其在胶质瘤发生发展中的重要作用逐渐显露出来。ID2对胚胎发育和细胞周期进程是必不可少的，并且对细胞增殖起着正向调节作用。除了对细胞分化的负调控外，ID2在神经发生、肿瘤新生血管形成和胶质瘤免疫微环境中发挥着重要作用。筛选所得的ID2抑制剂通过靶向ID2可以对胶质瘤的恶性发展起到较好的抑制效果。
附图说明
[0012]图1为表面等离子共振技术(SPR)检测AK778小分子抑制剂与ID2蛋白之间的亲和力的检测结果
[0013]图2为Annexin
Ⅴ-
FITC/PI双染借助流式细胞仪检测胶质瘤细胞凋亡的检测结果。
[0014]图3为Western blot实验检测胶质瘤恶性进展相关信号通路上关键基因表达的检测结果。
[0015]图4为AK778化合物抑制NCG小鼠皮下移植瘤胶质瘤U87的生长的检测结果。
具体实施方式
[0016]为了使本专利技术的目的、技术方案更加清楚明白，下面结合实施例对本专利技术作进一步描述，但本专利技术的实施不仅限于此。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如医学生物化学与分子生物学实验教程，2011年版，高等教育出版社中所述的条件。
[0017]本专利技术最初通过药效团建模虚拟筛选得到16种潜在的ID2小分子抑制剂。随后进行体外细胞试验从16种备选小分子化合物中进行生物活性测试，得到水溶性较好以及对胶
质瘤生长抑制IC
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较好的小分子化合物，将其命名为AK778/43420895，并测定其与ID2蛋白之间的亲和力。为进一步确定该抑制剂抑制肿瘤的功能，我们对AK778/43420895抑制剂作用后几种胶质瘤细胞的凋亡以及凋亡、侵袭相关基因的表达情况做了一系列检测。16种高效特异性小分子化合物抑制剂结构如下所示：
[0018][0019]CCK-8细胞实验检测16种备选ID2抑制剂对胶质瘤细胞的IC50值即半抑制浓度。
[0020]CCK-8细胞增殖检测试剂盒是一种基于WST-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性检测的快速灵敏度试剂盒。在电子耦合试剂存在的情况下，WST-8可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)，其颜色的深浅与存活细胞数目的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，可以间接反映活细胞的数量。具体操作步骤如下：
[0021]1、体外用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87、人脑胶质瘤细胞HS683和小鼠胶质瘤细胞GL261。
[0022]2、具体操作如下：取对数期生长的细胞用0.25％胰酶消化成细胞悬液，将细胞以4
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103cells/well的密度接种至96孔板中，100ul含10％胎牛血清本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小分子抑制剂及其衍生物在制备抗肿瘤药物方面的应用，其特征在于：所述小分子抑制剂结构式为：2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小分子抑制剂及其衍生物是通过抑制ID2的表达来抑制肿瘤的增殖。3.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟根深，王怡春，吴敏娜，林斌，黄毓杰，齐劲松，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：