一种3制造技术

本发明专利技术公开了一种3

【技术实现步骤摘要】
一种3
’
端羟基可逆封闭核苷酸合成测序法


[0001]本专利技术涉及基因测序方法，特别涉及一种3
’
端羟基可逆封闭核苷酸合成测序法。

技术介绍

[0002]随着DNA结构的发现，人们在理解基因组在健康和疾病中的复杂性和多样性方面取得了巨大的进步。人类基因组计划的开展和完成使人类步入了后基因时代，分子生物学等相关学科得到了迅猛发展。DNA测序技术已成为现代生物学研究的常规手段之一，推动我们对健康和疾病的理解取得革命性的进步。高通量DNA测序平台的推出大幅度降低了DNA测序成本，对当代生物学、医学等领域的研究产生了巨大的影响，同时，也是医学大数据的主要来源之一。目前市场上的成熟的商品化高通量DNA测序仪主要包括Roche公司的基于乳液PCR产物的454基因组测序仪；Illumina公司和Solexa technology公司合作开发的基于桥式扩增-DNA芯片延伸的Illumina测序仪；以及Applied Biosestems公司的基于乳液PCR产物的杂交-酶连接-酶切割的SOLiD测序仪、pH敏感场效应管阵列芯片的Ion Torrent测序仪。
[0003]在现有的合成测序技术中，主要通过两种方式实现：第一种是通过单个碱基的添加来确定每次合成的碱基的种类和数量，这种方式需要四个独立的反应来完成所有模板的一个碱基的测定从而会增加测序时间；第二种是采用循环可逆终止子，是指在合成反应中加入3
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端羟基可逆封闭的特殊核苷酸单体，这样每次反应只能延伸一个核苷酸，而且每个单体带有4种不同的标记，通过采集四色荧光之后从而确定每次合成的碱基种类和数量，这种方式在测定下一个碱基前需要进行3
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羟基的脱保护处理，而每增加一步反应将导致反应效率的降低，最终导致测序长度的下降。此外，这种让每个核苷酸携带不同标记，虽然能够直接通过读取荧光强度最大者为测序信息，可是也存在四种不同染料的发射波长可能重迭影响结果、标记成本高以及需要扫描四种染料而造成制造费用和测序时间的增加等问题，因此，如果采用单色标记方法实施高通量DNA测序，不仅测序仪器的复杂程度可以降低，扫描时间也能减少75％，从而也能缩短测序时长。“一种3
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端可逆封闭的两核苷酸实时合成测序方法”(中国专利技术专利号：201610592035.8)通过两次平行合成测序来解码待测模板的碱基信息，能克服同聚物或者类准同聚物的问题，提高测序的准确度。该方法完全采用未标记的3
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端可逆封闭的核苷酸，将四个核苷酸分成两组进行测序反应，通过检测焦磷酸或者氢离子来判断测序反应是否发生，只适合于实时合成测序、即需要单独的反应池，而每个单独的反应池需要占用一定的空间，限制了DNA测序通量，同时也提高了芯片制备架构费用；此外，该方法的第二个不足是由于每次测序反应只采用了四种类中的两种核苷酸，另外两种核苷酸因为缺失而容易造成错配核苷酸的合成，引起测序错误。虽然单个测序反应发生错配核苷酸的合成效率很低，但这些错误的积累将对测序长度造成危害，因此，该方法不是合成测序的最优选择。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：本专利技术目的是提供一种3
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端羟基可逆封闭核苷酸合成测序法，缩短测序时间，提高序列测定的长度及准确度，从而实现待测核酸序列的高通量检测。
[0005]技术方案：本专利技术提供一种3
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端羟基可逆封闭核苷酸合成测序法，包括单色标记或单次扫描双色标记核苷酸合成测序；
[0006]单色标记的核苷酸合成测序：测序反应由四种3
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端羟基可逆封闭的脱氧核苷酸单体同时进行，其中X、Y两个不同的脱氧核苷酸单体用同一种标记物标记记为X
*
、Y
*
(X、Y为碱基A、G、C、T四种中的两种)，另外两个脱氧核苷酸Z、W不标记(Z、W为碱基A、G、C、T四种中除X、Y对应两种外的剩余两种)，每次测序反应最多只能产生一个核苷酸的合成，通过比较标记物信息强度与背景数值，得到一个测序编码信息XY或者ZW，然后活化3
’
端羟基进行下一个测序反应，整个测序包括对同一模板进行若干个测序反应，并获得由(XY)、(WZ)这些编码构成测序信息；
[0007]单次扫描双色标记核苷酸合成测序：在(A
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、G
*1
、C
*2
、T
*2
)/(A
*1
、C
*1
、G
*2
、T
*2
)的循环测反应为，在奇数次的单次测序反应中，同时加入A
*1
、G
*1
、C
*2
、T
*2
进行延伸反应，通过单次扫描获得两种不同标记物信息强度，得到一个编码(AG)或者(CT)；在偶数次的单次测序反应中，同时加入A
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、C
*1
、G
*2
、T
*2
，通过单次扫描获得两种不同标记物信息强度，得到一个编码(AC)或者(GT)。在(A
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、T
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、C
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、G
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)/(A
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、G
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、C
*2
、T
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)的循环测反应为，在奇数次的单次测序反应中，同时加入A
*1
、T
*1
、C
*2
、G
*2
，通过单次扫描获得两种不同标记物信息强度，得到一个编码(AT)或者(CG)；在偶数次的单次测序反应中，同时加入A
*1
、G
*1
、C
*2
、T
*2
，通过单次扫描获得两种不同标记物信息强度，得到一个编码(AG)或者(CT)，然后通过比较两组对应编码中选出相同的碱基即完成对测序信息的解码，得到具体的碱基信息，其中，*1表示一种标记，*2表示另一种标记。
[0008]进一步地，单色标记的核苷酸合成测序包括如下步骤：
[0009](1)准备3
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端羟基可逆封闭核苷酸单体并进行单色标记；
[0010](2)人全基因组模板制备：将人基因组制成碱基片段，将这些片段化核酸序列用一对通用连接子进行连接，其中的一个通用连接子的寡核酸序列与扩增引物的序列完全互补，而另一个连接子的寡核酸序列包含了所有测序引物的序列信息，将这些连接臂连接的片段化核酸序列与固定连接子互补序列到微珠进行乳液并行PCR反应，扩增片段化的人全基因组，通过酶切或者变性得到人全基因组测序模板；
[0011](3)测序引物的杂交：将5
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端固定的模板与能和3
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端连接子互补的引物杂交，杂交引物作为所有人全基因组DNA模板的测序引物；
[0012](4)测序：
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种3
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端羟基可逆封闭核苷酸合成测序法，其特征在于：包括单色标记或单次扫描双色标记核苷酸合成测序；单色标记的核苷酸合成测序：测序反应由四种3
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端羟基可逆封闭的脱氧核苷酸单体同时进行，其中X、Y两个不同的脱氧核苷酸单体用同一种标记物标记记为X
*
、Y
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(X、Y为碱基A、G、C、T四种中的两种)，另外两个脱氧核苷酸Z、W不标记(Z、W为碱基A、G、C、T四种中除X、Y对应两种外的剩余两种)，每次测序反应最多产生一个核苷酸的合成，通过比较标记物信息强度与背景数值，得到一个测序编码信息XY或者ZW，然后活化3
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端羟基进行下一个测序反应，整个测序包括对同一模板进行若干个测序反应，并获得由(XY)、(WZ)这些编码构成测序信息；单次扫描双色标记核苷酸合成测序：在(A
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、G
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、C
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、T
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)/(A
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、G
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、T
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)的循环测反应为，在奇数次的单次测序反应中，同时加入A
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、G
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、C
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进行延伸反应，通过单次扫描获得两种不同标记物信息强度，得到一个编码(AG)或者(CT)；在偶数次的单次测序反应中，同时加入A
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、C
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、G
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、T
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，通过单次扫描获得两种不同标记物信息强度，得到一个编码(AC)或者(GT)。在(A
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、T
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、C
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、G
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)/(A
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、G
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、C
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、T
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)的循环测反应为，在奇数次的单次测序反应中，同时加入A
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、T
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、C
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、G
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，通过单次扫描获得两种不同标记物信息强度，得到一个编码(AT)或者(CG)；在偶数次的单次测序反应中，同时加入A
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、G
*1
、C
*2
、T
*2
，通过单次扫描获得两种不同标记物信息强度，得到一个编码(AG)或者(CT)，然后通过比较两组对应编码中选出相同的碱基即完成对测序信息的解码，得到具体的碱基信息，其中，*1表示一种标记，*2表示另一种标记。2.根据权利要求1所述的3
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端羟基可逆封闭核苷酸合成测序法，其特征在于：单色标记的核苷酸合成测序包括如下步骤：(1)准备3
’
端羟基可逆封闭核苷酸单体并进行单色标记；(2)人全基因组模板制备：将人基因组制成碱基片段，将这些片段化核酸序列用一对通用连接子进行连接，其中的一个通用连接子的寡核酸序列与扩增引物的序列完全互补，而另一个连接子的寡核酸序列包含了所有测序引物的序列信息，将这些连接臂连接的片段化核...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖鹏锋，成楚，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：