一种多位点结直肠癌甲基化检测引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种多位点结直肠癌甲基化检测引物探针组及试剂盒，使用两个四重荧光定量PCR反应即可完成六个靶基因的检测，不仅能高效准确地完成粪便样本甲基化检测，而且能进一步降低了检测费用，最低检测限为1％；重复性良好；灵敏度为100％；特异性为94.5％；具有广阔的应用空间。阔的应用空间。

【技术实现步骤摘要】
一种多位点结直肠癌甲基化检测引物、探针及试剂盒


[0001]本专利技术分子检测
，更具体地，涉及一种多位点结直肠癌甲基化检测引物、探针及试剂盒。

技术介绍

[0002]结直肠癌(colorectal cancer)是消化系统中最常见的恶性肿瘤，由于其早期症状不明显，常常会被人们所忽视，随着癌肿的增大才会表现出排便习惯改变、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛以及便血等症状，晚期则表现贫血、体重减轻等全身症状。其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。
[0003]结直肠癌是人类高发恶性肿瘤，其发病率一直呈上升趋势，而且早期结直肠癌的症状不明显，导致大部分病例在发现时已为晚期，预后效果极差。因此结直肠癌的早期筛查十分重要。目前最常用的结直肠癌筛查方法是肠镜检查和粪便隐血检测。前者为结直肠癌确诊的“金标准”之一，具有95％以上的灵敏度，但具有侵入性，检查过程中会产生疼痛以及让筛查者心理产生不适，很大部分病人由于对侵入性肠镜的恐惧而错过了早期病灶的筛查和发现，待确诊已为中晚期；后者虽然为无创检查，但是靶向性很低，仅有73％的灵敏度，还需要进一步配合肠镜才能确诊，因此寻找一种无创的高靶向性的结直肠癌早期筛查手段刻不容缓。
[0004]随着人类基因组学的蓬勃发展，人体表观遗传学的改变，特别是基因启动子区发生甲基化，被认为是癌症首发的重要原因。近年越来越多的研究显示人类肿瘤的发生、发展与DNA甲基化的异常有关，而且早在肿瘤临床确诊之前就可检测出特异基因的甲基化异常现象。因此特异基因的甲基化可以作为癌症早期诊断的分子标记物、治疗的靶点甚至是判断预后的手段。美国FDA批准的第一个粪便DNA检测试剂盒“colonguard”是通过检测粪便中的NDRG4基因和BMP3基因的甲基化程度，辅助结直肠癌的诊断，但其特异性仅有86.6％。目前市面上还有对外周血的Septin9基因的甲基化程度进行检测的试剂盒，但灵敏度仅有70％，也无法满足临床要求。目前市面上对粪便样本甲基化进行检测以辅助诊断结直肠癌的试剂盒仍存在较多不足，其检测的灵敏度不够或特异性不高，不仅如此，其检测费用也较高，为大部分人群所不能接受，也就无法广泛应用到结直肠癌的筛查中去。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题为针对粪便样本甲基化检测技术的现有不足，提供灵敏度高和特异性强的甲基化检测材料及其试剂盒与应用。可以降低试剂盒检测的成本，以满足结直肠癌大规模筛查的需要，提高结直肠癌的早期确诊率和治愈率。
[0006]本专利技术的第一个方面，提供一组特异性引物，包括用于扩增NDRG4基因、SDC2基因、PDX1基因、TFPI2基因、BMP3基因和SFRP2基因的启动子区高甲基化区域的特异性引物。
[0007]本专利技术的第二个方面，提供一组特异性探针，包括靶向NDRG4基因、SDC2基因、PDX1基因、TFPI2基因、BMP3基因和SFRP2基因的启动子区高甲基化区域的特异性探针。
[0008]本专利技术的第三个方面，提供一种检测材料，包括本专利技术第一个方面所述的特异性引物和/或本专利技术第二个方面所述的特异性探针。
[0009]本专利技术的第四个方面，提供一种检测试剂盒，包含本专利技术第三个方面所述的检测材料。
[0010]本专利技术的第五个方面，提供本专利技术第三个方面所述的检测材料在制备结直肠癌检测制剂中的应用。
[0011]本专利技术所采取的技术方案是：
[0012]本专利技术的第一个方面，提供一组特异性引物，包括用于扩增NDRG4基因、SDC2基因、PDX1基因、TFPI2基因、BMP3基因和SFRP2基因的启动子区高甲基化区域的特异性引物。
[0013]进一步地，所述特异性引物的核苷酸序列如下所示：
[0014]用于扩增NDRG4基因的引物：
[0015]NDRG-F2：GAGCCGTTATTTCGTCGG(SEQ ID NO.2)；
[0016]NDRG-R2：GCGTAACCGAAAATTCTAC(SEQ ID NO.5)；
[0017]用于扩增BMP3基因的引物：
[0018]BMP-F1：CGTTATCACGAAGTATCACGA(SEQ ID NO.10)；
[0019]BMP-R1：GAAACCGACACGAATAAACTC(SEQ ID NO.11)；
[0020]用于扩增SDC2基因的引物：
[0021]SDC-F2：GAGTAGGGCGGGCGTAAG(SEQ ID NO.14)；
[0022]SDC-R1：AACACACGTCGATTGAAACA(SEQ ID NO.15)；
[0023]用于扩增TFPI2基因的引物：
[0024]TFPI-F2：AGGCGTTTTTTATCGCGTT(SEQ ID NO.18)；
[0025]TFPI-R2：CACACACCCGTCTTACCCA(SEQ ID NO.20)；
[0026]用于扩增PDX1基因的引物：
[0027]PDX-F1：ACGCGCGTTTATTATGCACGGTCCCG(SEQ ID NO.22)；
[0028]PDX-R1：AATTACCTGCGATTATCGGCACAGT(SEQ ID NO.23)；
[0029]用于扩增SFRP2基因的引物：
[0030]SFRP-F1：CGTTCGTAGGGTTACGATCG(SEQ ID NO.25)；
[0031]SFRP-R1：ACGCGCTATGTTCGCAAATTA(SEQ ID NO.28)。
[0032]本专利技术的第二个方面，提供一组特异性探针，包括靶向NDRG4基因、SDC2基因、PDX1基因、TFPI2基因、BMP3基因和SFRP2基因的启动子区高甲基化区域的特异性探针。
[0033]进一步地，本专利技术所述特异性探针的核苷酸序列如下所示：
[0034]靶向NDRG4的探针：
[0035]NDRG-P2：TTCGTTCGGGAGTTCGTTCCGCGTTTT(SEQ ID NO.8)；
[0036]靶向BMP3的探针：
[0037]BMP-P1：CGAGTCGGGTTTCGTGCGTTTTCGT(SEQ ID NO.12)；
[0038]靶向SDC2的探针：
[0039]SDC-P1：CGAGCACCGAGAACTCGCGTTCGCGAG(SEQ ID NO.16)；
[0040]靶向TFPI2的探针：
[0041]TFPI-P1：AGCGAACCGACGAATATCGG(SEQ ID NO.21)；
[0042]靶向PDX1的探针：
[0043]PDX-P1：AGCTGAACCGTTCGCAGCCGGGAGTATT(SEQ ID NO.24)；
[0044]靶向SFRP2的探针：
[0045]SFRP-P1：TAATCGCGTTAT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组特异性引物，包括用于扩增NDRG4基因、SDC2基因、PDX1基因、TFPI2基因、BMP3基因和SFRP2基因的启动子区高甲基化区域的特异性引物。2.根据权利要求1所述的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列如下所示：用于扩增NDRG4基因的引物：NDRG-F2：GAGCCGTTATTTCGTCGG(SEQ ID NO.2)；NDRG-R2：GCGTAACCGAAAATTCTAC(SEQ ID NO.5)；用于扩增BMP3基因的引物：BMP-F1：CGTTATCACGAAGTATCACGA(SEQ ID NO.10)；BMP-R1：GAAACCGACACGAATAAACTC(SEQ ID NO.11)；用于扩增SDC2基因的引物：SDC-F2：GAGTAGGGCGGGCGTAAG(SEQ ID NO.14)；SDC-R1：AACACACGTCGATTGAAACA(SEQ ID NO.15)；用于扩增TFPI2基因的引物：TFPI-F2：AGGCGTTTTTTATCGCGTT(SEQ ID NO.18)；TFPI-R2：CACACACCCGTCTTACCCA(SEQ ID NO.20)；用于扩增PDX1基因的引物：PDX-F1：ACGCGCGTTTATTATGCACGGTCCCG(SEQ ID NO.22)；PDX-R1：AATTACCTGCGATTATCGGCACAGT(SEQ ID NO.23)；用于扩增SFRP2基因的引物：SFRP-F1：CGTTCGTAGGGTTACGATCG(SEQ ID NO.25)；SFRP-R1：ACGCGCTATGTTCGCAAATTA(SEQ ID NO.28)。3.一组特异性探针，包括靶向NDRG4基因、SDC2基因、PDX1基因、TFPI2基因、BMP3基因和SFRP2基因的启动子区高甲基化区域的特异性探针。4.根据权利要求3所述的特异性探针，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁美，陆家雯，赖国锋，杜颜，冯雪，
申请(专利权)人：广州齐凯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：