铜绿假单胞菌III型分泌型蛋白PcrV及其诱导极化的巨噬细胞的应用制造技术

本发明专利技术属于医药领域，特别涉及一种铜绿假单胞菌III型分泌型蛋白PcrV及其诱导极化的巨噬细胞的应用，所述应用可促进小鼠肺癌细胞凋亡并增加对肺癌细胞吞噬作用，对运用于肿瘤的免疫治疗具有重要的市场前景。免疫治疗具有重要的市场前景。免疫治疗具有重要的市场前景。

【技术实现步骤摘要】
铜绿假单胞菌III型分泌型蛋白PcrV及其诱导极化的巨噬细胞的应用


[0001]本专利技术属于医药领域，特别涉及一种铜绿假单胞菌III型分泌型蛋白PcrV及其诱导极化的巨噬细胞的应用。

技术介绍

[0002]肺癌是呼吸系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率及致死率极高，预后极差，患者五年生存期不足18％。目前肺癌治疗主要以手术切除、放疗及化疗为主。然而，由于肺癌细胞对放化疗敏感性差，且具有高侵袭和高转移特性，常导致治疗效果不理想。因此，进一步探寻肺癌治疗的新思路和策略，可为临床上肺癌的治疗提供重要的理论支持。
[0003]巨噬细胞是调节机体免疫应答的重要效应细胞，在肿瘤组织中大量浸润。然而，肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)主要以M2极化状态存在。据研究报道，M2极化的TAMs可通过产生转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGFβ)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)等多种因子促进肿瘤的生长、血管生成和转移。此外，M2 TAMs也可通过产生白介素4(interleukin 4，IL4)和IL10等多种免疫抑制因子维持肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)的免疫抑制状态，进而促进肿瘤的发生和发展。由于巨噬细胞具有高度异质性和可塑性，在细菌脂多糖LPS和干扰素IFNγ等促炎因子刺激下，M2极化的TAMs可表现出与其促肿瘤效应不同的抗肿瘤的M1极化相关生物学活性。M1极化的TAMs主要通过产生大量肿瘤坏死因子、一氧化氮和活性氧等细胞毒性因子或通过增强吞噬作用等途径，促进对肿瘤细胞的杀伤。目前，研究证实诱导TAMs由M2型向M1型转化，对抑制多发性骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌、肝细胞癌等多种肿瘤的生长、血管生成、侵袭及转移均具有明显效果。然而，诱导TAMs的M1极化同样可促进部分促炎因子或促肿瘤相关因子表达，进而减弱M1巨噬细胞介导的抗肿瘤效应并可能促进肿瘤的反生和发展。因此，通过诱导TAMs M1极化并发挥其最大的抗肿瘤效应，而尽量减弱M1极化引起的促肿瘤潜在风险，是将巨噬细胞用于抗肿瘤免疫治疗的关键。
[0004]目前已有研究证实，采用灭活或减毒的结核杆菌、沙门氏菌、李斯特菌及梭状芽孢杆菌等用于肿瘤治疗可明显抑制肿瘤生长和转移。然而，由于细菌疗法具有明显的毒副作用，将其用于临床研究仍有一定风险。研究发现，采用微生物相关结构组分或分泌蛋白可通过激活巨噬细胞相关信号通路促进巨噬细胞M1极化，提示采用微生物相关结构组分或分泌蛋白诱导TAMs向M1极化可能在抗肿瘤中发挥效应。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种铜绿假单胞菌III型分泌型蛋白PcrV及其诱导极化的巨噬细胞的应用，所述应用可促进小鼠肺癌细胞凋亡并增加对肺癌细胞吞噬作用。此外，采用PcrV蛋白处理小鼠肺癌细胞并不明显增加肿瘤细胞生长、转移相关分子表达，避免了PcrV
用于肿瘤治疗可能存在促进肿瘤生长及转移的潜在风险。因此，将该方法运用于肿瘤的免疫治疗具有重要的应用前景。
[0006]本专利技术的技术方案是：
[0007]铜绿假单胞菌III型分泌系统分泌型蛋白PcrV蛋白在制备治疗肺癌的药物中的应用。
[0008]铜绿假单胞菌III型分泌系统分泌型蛋白PcrV蛋白通过诱导巨噬细胞极化在制备治疗肺癌药物中的应用。
[0009]所述巨噬细胞为M1型。
[0010]铜绿假单胞菌III型分泌系统分泌型蛋白PcrV蛋白诱导极化的M2 BMs在制备治疗肺癌药物中的应用。
[0011]所述药物用于吞噬导致疾病发病的Lewis肺癌细胞。
[0012]上述应用中所述药物用于促进肺癌细胞的凋亡。
[0013]所述肺癌细胞为Lewis肺癌细胞。
[0014]申请人的实验表明，采用铜绿假单胞菌III型分泌系统分泌型蛋白PcrV处理M2型巨噬细胞(TAM类似表型细胞)可促进细胞向M1型极化。将PcrV蛋白处理的M2型巨噬细胞与小鼠肺癌细胞共培养，其可促进小鼠肺癌细胞凋亡并增加对肺癌细胞吞噬作用。此外，采用PcrV蛋白或经PcrV蛋白诱导的巨噬细胞进行Lewis肺癌皮下荷瘤小鼠瘤内注射可抑制小鼠肿瘤生长并促进肿瘤组织凋亡，表明PcrV蛋白在抗肺癌中具有明显的生物学活性。
[0015]与传统细菌疗法相比，本专利技术所述应用通过采用细菌蛋白调节TME中巨噬细胞极化状态，并进一步起到抗肿瘤效应，更有利于激活机体自身抗肿瘤免疫应答，并大大降低细菌毒副作用。此外，该细菌蛋白可通过大肠杆菌表达系统大量获取，并可通过目前已成熟的实验技术去除细菌内毒素，大大降低了蛋白使用成本及风险。将其运用于肿瘤的免疫治疗具有重要的潜在运用价值。
附图说明
[0016]附图1为PcrV蛋白极化的M2 BMs可促进小鼠LLC细胞凋亡，其中，A：流式细胞术检测LLC细胞凋亡；B：细胞凋亡统计图；
[0017]附图2为Western blot检测M2 BMs-LLC细胞共培养后LLC细胞Caspase 3的剪切情况；
[0018]附图3为PcrV蛋白极化的M2 BMs对小鼠LLC细胞吞噬作用增强，其中，A：流式细胞术检测巨噬细胞对LLC细胞的吞噬；B：细胞吞噬统计图；
[0019]附图4为PcrV蛋白可抑制Lewis肺癌皮下荷瘤小鼠肿瘤生长，其中，A：小鼠肿瘤体积测定；B：小鼠肿瘤重量；
[0020]附图5为PcrV蛋白极化的巨噬细胞可抑制Lewis肺癌皮下荷瘤小鼠肿瘤生长，其中，A：小鼠肿瘤体积测定；B：小鼠肿瘤重量；
[0021]附图6为TUNEL染色法检测小鼠肿瘤组织凋亡。
[0022]附图7为PcrV蛋白处理小鼠LLC肺癌细胞后细胞生长及转移相关基因及转移能力检测，其中，A：LLC细胞生长及转移相关基因表达水平检测；B：细胞转移能力检测；
具体实施方式
[0023]一.材料和试剂
[0024](一)动物和细胞
[0025]6-8周龄雄性C57BL/6小鼠 北京百奥赛图基因生物技术有限公司；
[0026]小鼠Lewis肺癌细胞(LLC细胞) 中国中科院细胞库。
[0027](二)主要试剂及配制
[0028][0029][0030][0031]10％FBS/DMEM配制：10ml FBS和1ml青链霉素双抗加入90ml DMEM。PBS缓冲液配制(0.01mol/L,pH 7.4)：NaCl 8.00g，KCl 0.20g，KH2PO
4 0.20g，NaH2PO4·
H2O 1.56g，1000ml ddH2O溶解，高温高压灭菌，4℃保存。
[0032](三)主要仪器设备
[0033][0034][0035]二、实施例
[0036]实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.铜绿假单胞菌III型分泌系统分泌型蛋白PcrV蛋白在制备治疗肺癌的药物中的应用。2.铜绿假单胞菌III型分泌系统分泌型蛋白PcrV蛋白通过诱导极化的巨噬细胞在制备治疗肺癌药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特在于：所述巨噬细胞为M1型。4.铜绿假单胞菌III型分泌系统分泌型蛋白PcrV...

【专利技术属性】
技术研发人员：余华，张克斌，何小梅，熊浚智，邱静，代黔，李园园，张乐，李巧巧，王兴敏，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：