医药组合物制造技术

本发明专利技术提供了非水溶性盐形式的含有水、水蛭素和钙、镁或锌离子的含水贮存配制品。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及水蛭素的含水配制品，特别是涉及贮存配制品。水蛭素，作为一种天然存在于水蛭(Hjrudo medicinalis)中的抗凝血剂，并不是单一的多肽，而是一类至少由四种肽组成的有等同作用的多肽，它们分别称为水蛭素变异体1(HV1)、水蛭素变异体2(HV2)(参见欧洲专利申请No.158 564)、水蛭素变异体3(PA)(参见PCT申请No.86/03493)和“脱-(Val)2-水蛭素”(参见欧洲专利申请No.158 986)。这些变异体在结构上彼此差异在于氨基酸数目不同(具体的说，HVI的N末端是Val-Val-Tyr，HV2和HV3的N末端是Thr-Tyr)，但它们的共有特征是在N末端有疏水氨基酸积聚，在C末端有极性氨基酸积聚，酷氨酸残基(Tyr63)作为硫酸单酯存在、有三个二硫桥键以及都有抗凝血活性。在过去的几年里，已克隆并在微生物宿主中表达了编码水蛭素变异体的CDNA和合成基因。虽然表达产物在Tyr63位缺少硫酸单酯基团并因此被称为“脱硫酸水蛭素”，但已证明它们表现有与天然硫酸化水蛭素差不多相同的生物学活性。已在大肠杆菌中(欧洲专利申请No.158 564和168 342)和啤酒酵母中(欧洲专利申请No.168 342、200 655、225 633、252 854和341 215)表达了脱磷酸水蛭素变异体HV1。同样，已在大肠杆菌中(欧洲专利申请No.158 564)和啤酒酵母中(欧洲专利申请No.200 655，PCT申请No.86/01224)表达了脱硫酸水蛭素HV2，并在大肠杆菌中(欧洲专利申请No.158 986)表达了脱-(Val)2-脱硫酸水蛭素。根据本专利技术，术语“水蛭素”意欲包括分别在文献中描述的水蛭素、脱硫酸水蛭素、水蛭素变异体或脱硫酸水蛭素变异体或其突变体，且特别是可从含有编码脱硫酸水蛭素或其突变体之DNA的被转化的微生物菌株得到的脱硫酸水蛭素或其突变体。例如，这些脱硫酸水蛭素是脱磷酸水蛭素变异体HV1、HV1修饰的( a、b)、HV2、HV2修饰的(a、b、c)、HV3和脱-(Val)2-脱硫酸水蛭素的变异体。优选的脱硫酸水蛭素具有下列结构式(SEQ ID NO1) 其中a)27、36和47位的Xaa各自是Lys，51位的Xaa是His且62位的Xaa是肽残基Glu-Tyr-Leu-Gln(MV1)，或b)27位的Xaa是Ile或Glu，36、47、51和62位的Xaa是如a)中限定的氨基酸(HV1修饰的a)，或c)36位的Xaa是Ile或Glu，且27、47、51和62位的Xaa是如a)中限定的氨基酸(HV1修饰的a)，或d)47位的Xaa是Ile或Glu，且27、36、51和62位的Xaa是如a)中限定的氨基酸(HV1修饰的a)，或e)51位的Xaa是Ieu或Asp，且27、36、47和62位的Xaa是如a)中限定的氨基酸(HV1修饰的a)，或f)62位的Xaa选自Glu-Tyr、Glu-Tyr-Leu、Glu-Asp-Leu-Gln、Glu-Glu-Leu-Gln、Glu-Tyr-Lys-Arg、Glu-Asp-Lys-Arg、Glu-Lys-Leu-Gln、Ser-Phe-Arg-Tys、Trp-Glu-Leu-Arg、Glu-Tyr-Leu-Gln-Pro和Glu-Tyr-Leu-Gln-Arg，且27、36、47和51位的Xaa是如a)中限定的氨基酸(HV1修饰的b)，或具有下列结构式(SEQ ID NO2) 或具有下列结构式(SEQ ID NO3) 其中a)47位的Xaa是Asn，且63位的Xaa是Tyr(HV2)，或b)47位的Xaa是Lys、Arg或His，且63位的Xaa是Tyr(HV2修饰的a)，或c)63位的Xaa是Glu或Asp且47位的Xaa是Asn(HV2修饰的b)，或具有下列结构式(SEQ IN NO4) 或具有下列结构式(SEQ ID NO5)的脱硫酸水蛭素。 (Ⅴ)HV3和所说HV3之变异体的特征是使一级结构在N末端缩短1或2个氨基酸，或在C末端缩短18、10、9、6、4或2个氨基酸。特别优选的脱硫酸水蛭素化合物是其中Xaa基团为a)所限定之基团的式I化合物，或是其中47位Xaa为Lys且63位Xaa为Tyr的化合物。最优选的水蛭素是具有其中27、36和47位Xaa各自为Lys、51位Xaa为His且62位Xaa为肽残基Glu-Tyr-Leu-Gln之式I结构的脱硫酸水蛭素HV1。可合成，如用化学法或较好用重组技术，或者从水蛭中分离制得用于本专利技术的水蛭素。根据本专利技术，术语“突变体”是指基于简单的或多点突变而不同于天然水蛭素或脱硫酸水蛭素又表现有抗凝血活性的蛋白质(突变蛋白)(参见欧洲专利申请No.352 227和No.352 228)。已克隆并在微生物宿主如大肠杆菌和啤酒酵母中表达了可用本领域已知方法如定点诱变技术制得的编码所说突变体的DNA。用于本专利技术的水蛭素化合物可以是游离形式的，但也可以是其盐形式的。因为它们在几个氨基酸残基含有游离氨基基团，所以这些化合物可以是酸加成盐形式的。适用的酸加成盐是与常规治疗上可接受的盐结合形式的特定的医药上可接受的盐。有代表性的无机酸是氢卤酸(如盐酸)，以及硫酸、磷酸和焦磷酸。有代表性的有机酸具体是芳基磺酸(如苯磺酸或对位甲苯磺酸)，或低级烷基磺酸(如甲磺酸)，以及羧酸如乙酸、乳酸、棕榈酸、硬脂酸、苹果酸、酒石酸、抗坏血酸和柠檬酸。但因为用于本专利技术的化合物也在几个氨基酸残基中含有游离羧基，而这些羧基基团赋予整个肽以酸性性质，所以它们也可以是与无机或有机碱形成的盐，如钠、铆、钙或镁盐，或者也可以是由氨或医药上可接受的有机含氮碱衍生的铵盐。但因为它们同时含有游离羧基和游离氨基基团，所以它们也可以是惰性盐形式的。最好选用药理学上可接受的盐。在开发含水蛭素之剂型中的一个问题是它在水溶液中的稳定性差。这就是开发预装注射器配制品，即一种具有更易被病人接受且降低了生产成本等优点剂型中的主要障碍。当用色谱法分析水蛭素时即可看到这种不良稳定性。Mono-Q方法使用Mono-Q柱(颗粒大小10μm，5.0×50mm，购自Pharmacia)，以FPLC(游离蛋白质液相层析)方法分析水蛭素的稳定性。该方法是由Ciba-Geigy，Basel建立的。溶剂A是溶于水中的50mMHCOONH4(PH4.5)，溶剂B是加在水中的50mMHCOONH4(PH3.5)。洗脱是使用1.4ml/分钟的流速在室温下完成的。前5分钟的二元洗脱液是以20%B的恒定流完成的，然后是历时10分钟的20%B至75%B的线性梯度，并以100%B洗脱2分钟，其后以20%B的起始条件将柱平衡2分钟。Prcpac方法也可使用最近公开的水蛭素分析方法。该方法中使购自Dionex的Pro Pac PAl阴离子交换柱(内径250×4mm)。溶剂A是20mM Tris-HCl，PH7.0，且溶剂B是加在A中的0.5M NaCl以28%常液洗脱5分钟，然后是流速为1.3ml/分钟，历时60分钟的从28%B至54%的线性梯度洗脱。附图说明图1中显示了使用Mono Q和Propac方法分析溶于水中(2本文档来自技高网...

【技术保护点】
非水溶性盐形式的含有水、水蛭素和钙、镁或锌离子的含水贮存配制品。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：T阿文特，
申请(专利权)人：诺瓦提斯公司，UCP制药总公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]