稳定的TCR结构及应用制造技术

本发明专利技术公开一种稳定的TCR结构及获得方法和应用，将TCR分子的可变区与抗体恒定区进行组合，并对抗体恒定区的链间二硫键进行突变，将嵌合的片段插入到噬菌体质粒载体里，将构建好的噬菌体质粒转化到菌株中，然后将带有该噬菌体质粒的菌株进行培养，获得展示嵌合TCR的噬菌体上清；通过捕获ELISA对各个嵌合的TCR噬菌体的展示水平进行检测，筛选出可以在噬菌体表面展示的稳定的TCR结构；在筛选出的稳定的TCR结构基础上，在TCR可变区和抗体恒定区之间增加连接头，比较噬菌体表面的TCR展示和结合活性，筛选出最优的TCR结构。本发明专利技术筛选出的TCR结构能够在噬菌体表面稳定展示，具有亲和力好、稳定性高的特点，可以用于对TCR亲和力成熟的筛选。熟的筛选。熟的筛选。

【技术实现步骤摘要】
稳定的TCR结构及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种在噬菌体表面稳定展示的TCR结构及其获得方法和应用。

技术介绍

[0002]抗体能够以特异性识别的方式结合抗原，发挥生物学作用，是目前重要的治疗性生物药开发方向；与抗体类似，T细胞受体(TCR)，可以特异性识别细胞表面递呈的MHC/peptide，发挥生物学作用，TCR是由α链/β链或者γ链/δ链以异二聚体形式存在的细胞膜表面的糖蛋白，95％的T细胞中TCR异质二聚体由α和β链组成，而5％的T细胞具有由γ和δ链组成。在免疫系统中，通过TCR与组织相容性复合体多肽复合物(pMHC)的特异性结合引发T细胞与抗原呈递细胞(APC)物理接触，然后T细胞及APC的其他细胞膜表面分子就发生相互作用，引起了一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应，使得不同抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。因此，TCR和抗体一样，可以被开发应用于诊断和治疗。由于TCR识别的递呈肽很多来自于细胞内靶点，相较于抗体仅能识别细胞表面或者细胞外靶点，TCR识别的靶点更多更广泛，占总靶点数的约80％
[1]。
[0003]但是TCR分子的开发有其难点，主要是亲和力和稳定性。亲和力方面，SPR分析TCR与特异性的pMHCI结合表明野生型TCR亲和力在范围～1
–
100μM内，并且快速解离(～1-10s)，这种快速解离使得可溶性TCR无法有效定位在靶细胞上发挥生物学作用；稳定性方面，天然存在的TCR通过其跨膜区以及形成TCR/CD3复合物得以稳定，但对TCR胞外段蛋白表达时，很难保持可溶性和结合活性
[2]，表现为稳定性较差，表达产量低，聚集，错折叠和无效的链配对的问题
[3～5]。
[0004]为提高TCR的亲和力以及稳定性，研究人员尝试了可溶性TCR的制备，但效果并不理想。例如单链TCR(scTCR)，通过柔性接头(linker)连接两个可变区，但通过简单地连接α和β链从而使两者在单一的开放读框中表达并生产功能性α/β类似物并没有获得成功。还有尝试将TCR的α和β链与其他结构域连接，如亮氨酸拉链，人恒定抗体κ结构域或TCR恒定β结构区，或者通过在TCR恒定结构域之间引入非天然二硫键的dsTCR
[6～11]，仅部分成功表达为可溶性TCR。
[0005]鉴于制备可溶性TCR的技术还未成熟，研究人员选择通过展示的方法对TCR的亲和力及稳定性进行改造。Holler等报道通过酵母展示单链TCR(scTCR)筛选稳定的小鼠2C TCR突变体，增加其亲和力约100倍，至9nM
[12]。但是进一步研究表明这个亲和力成熟的2C TCR突变体有较强的交叉反应，特异性低
[13]。Weidanz等报道了对单链小鼠TCR的噬菌体展示，但没有获得高亲和力的TCR
[14]。Kristin等利用scTCR的噬菌体展示系统，进行了一个TCR稳定性筛选
[15]，Plaksin等尝试通过优化scTCR的Vα-VβCβ连接头(linker)来提高scTCR的表达
[16]。scTCR在噬菌体上进行展示和工程化改造虽然一直在优化中，但是没有成功案例。Immunocore人为在Cα和Cβ间引入二硫键，使TCR获得稳定性并展示在噬菌体的表面，进行亲和力筛选，其中针对NY-ESO-1的TCR亲和力提高至26pM
[17]。
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技术实现思路

[0024]天然TCR亲和力太低，难以成药(可溶性TCR药物甚至是TCR-T)，需要对其进行亲和力成熟和特异性筛选，常用于抗体亲和力成熟的方式是运用噬菌体展示技术进行筛选，但天然TCR是膜结合形式，难以在噬菌体表面获得稳定的展示并保持结合活性，因此需要获得一个稳定的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种获得稳定的TCR结构的方法，其特征在于，包括：1)将TCR分子的可变区Vα、Vβ与抗体恒定区进行组合，所述抗体恒定区包括：IgG1、IgG2、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、IgE抗体的重链恒定区CH1区域以及轻链恒定区κ、λ，拼接出多种TCR结构；并对抗体恒定区的链间二硫键进行突变，将嵌合的片段插入到噬菌体质粒pcom3xx-DT载体里，其中轻链恒定区末端融合表达Flag标签，重链恒定区末端融合表达6His.C-myc标签，并与噬菌体geneIII外壳蛋白融合；2)将构建好的噬菌体质粒pcom3xx-DT-TCRs转化到TG1感受态细胞中，然后将带有该噬菌体质粒的TG1菌株进行培养；培养完成后离心去除菌体，获得展示嵌合TCR的噬菌体上清；3)通过捕获ELISA对各个嵌合的TCR噬菌体的展示水平进行检测，运用直接的噬菌体结合ELISA鉴定，用抗噬菌体M13碱性磷酸酶偶联的抗体，检测TCR展示噬菌体与特异性MHCI-peptide的结合活性；根据噬菌体展示的水平以及与特异MHCI-peptide结合活性，筛选出可以在噬菌体表面展示的稳定的TCR结构；4)在筛选出的稳定的TCR结构基础上，在TCR可变区和抗体恒定区之间增加连接头，所述li...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐曼，张丽英，刘娟，根纳季，
申请(专利权)人：上海药明生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：