硅基罗丹明荧光染色试剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种硅基罗丹明荧光染色试剂及其制备方法和应用，属于有机化学和生物化学领域。本发明专利技术以硅原子取代的罗丹明衍生物为基础骨架，通过进行不同形式的芳香胺的修饰，合成了具有大斯托克斯位移、高荧光强度能够标记免疫球蛋白IgG的硅基罗丹明荧光染色试剂，从而可用于体外SARS

【技术实现步骤摘要】
硅基罗丹明荧光染色试剂及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及有机化学和生物化学领域，尤其涉及免疫学
，具体涉及一种硅基罗丹明荧光染色试剂及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]SARS-CoV-2病毒是引起2019严重急性呼吸道综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)的一种新型冠状致病病原体，感染者以呼吸道症状和肺炎为主要临床表现。2020年2月药物国际病毒分类委员会将该病毒正式命名为SARS-CoV-2，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)将疾病命名为2019冠状病毒病(2019corona virus disease，COVID-19)。SARS-CoV-2病毒传播能力强、潜伏时间长、发病率高，传统的病毒防御措施控制效果不佳，全球大流行趋势明显，病毒防控形势严峻。
[0003]SARS-CoV-2属于β属冠状病毒B亚群。高分辨电子显微镜观察，SARS-CoV-2病毒表面存在日冕状突起，形似王冠。基因测序分析显示，SARS-CoV-2与SARS-CoV存在80％的同源性和MERS-CoV有50％的同源性。SARS-CoV-2病毒包含有棘突蛋白S(Spike)、基质蛋白M(matrix)，包膜蛋白E(Envelope)和核蛋白N(nuclearprotein)等结构蛋白。其中，S蛋白包含S1和S2两个片段。S1蛋白是病毒与宿主细胞识别的关键蛋白，以高亲和力与细胞表面的血管细胞受体血管紧张肽转化酶2(angiotensin.Convertingenzyme 2,ACE2)结合，具有抗原性和免疫原性。因此，S1蛋白也被作为抗病毒药物筛选和新型疫苗制备的主要靶点。
[0004]高传染性COVID-19在全球范围内蔓延，目前，快速、灵敏、安全地检测SARS-CoV-2病毒依然是病毒防控的关键。基于核酸检测的方法如实时定量PCR、恒温PCR等。虽然核酸检测的灵敏度较高，但仍然存在样本取样差异大、前期处理过程复杂、对实验操作人员的要求高、检测实验室需具有P2级以上生物安全级别以及样本需要冷链运输等问题，给感染者的快速排查带来一定的难度。与核酸检测的方法不同，酶联免疫结合方法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)的样本为全血或血清，与咽拭子相比，血样中病毒载量低、取样方便、操作简便、结果稳定、对实验室的要求性相对较低。因此，血清抗体的ELISA检测可以作为病毒核酸检测的有效补充或替代方法。
[0005]ELISA法是利用抗原和抗体特异性结合的原理对特定的抗原或血清抗体进行检测的方法。SARS-CoV-2病毒侵染宿主后，由于病毒表面蛋白的抗原性，而激活宿主自身的免疫应答过程。免疫细胞活化、增殖产生免疫效应物质抗体。COVID-19患者在感染SARS-CoV-2病毒后14天，即可在血清中检测到特异性免疫球蛋白IgG。
[0006]荧光法ELISA是将荧光染料通过特定的反应官能团与二抗IgG进行偶联，二抗与一抗特异性结合后，通过测定荧光强度值反映样本中抗原或抗体的含量。与紫外吸光法相比，荧光法具有检测灵敏度高、无需特定的底物、操作步骤较少、结果稳定可重复等优点，适用于免疫检测试剂盒的开发。但是，传统的染料如：花菁类、酞菁类和荧光素等由于斯托克位移小，在带宽为18nm的光栅式或滤光片式常规酶标仪中均存在激发光和发射光相互干扰的情况，限制了荧光法在ELISA检测中的应用。
[0007]因此，开发大斯托克位移、高荧光强度的荧光染料，并高效标记免疫球蛋白IgG，对于建立高灵敏度的荧光ELISA并用于SARS-CoV-2病毒特异性抗体检测具有重要的意义。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种基于硅原子取代的罗丹明衍生物骨架的大斯托克位移、高荧光强度的荧光染料及其制备方法和用途，以解决现有抗体标记染料斯托克斯位移小难以应用于荧光法ELISA检测的问题。
[0009]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0010]一种硅基罗丹明荧光染色试剂，具有式(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示结构：
[0011][0012]其中，R1为C1-C10烷基链或芳香基团。
[0013]在本专利技术的一些示例中，R1为亚甲基。
[0014]在本专利技术的一些示例中，R1为芳香基团：苯基、萘基或吡啶基。
[0015]在本专利技术较佳的实施例中，上述硅基罗丹明荧光染色试剂为：
[0016][0017]一种制备具有式(Ⅰ)的硅基罗丹明荧光染色试剂的方法，其包括以下步骤：
[0018](1.1)将间溴苯胺和1，4-二溴丁烷溶于第一有机溶剂中并加入第一弱碱加热搅拌，反应得到中间体A1；
[0019](1.2)在惰性气氛下将所述中间体A1加入至三氯氧磷和DMF的混合溶液中搅拌，然后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，得到中间体A2；
[0020](1.3)将所述中间体A2和第一还原剂加入至第二有机溶剂中搅拌，然后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，得到中间体A3；
[0021](1.4)将所述中间体A1和所述中间体A3加入至第三有机溶剂，加入三氟化硼乙醚搅拌，反应得到中间体A4；
[0022](1.5)将所述中间体A4溶于第四有机溶剂并将溶液冷却至0℃以下，加入强碱，在搅拌下加入二氯二甲基硅烷，随后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，得到中间体A5；
[0023](1.6)将所述中间体A5溶于第五有机溶剂中，在搅拌下加入高锰酸钾继续搅拌，反应得到中间体A6；
[0024](1.7)将所述中间体A6溶于第六有机溶剂中，在搅拌下加入第二弱碱，再加入三氟甲磺酸酐，在搅拌下加入制得具有式(Ⅰ)的硅基罗丹明荧光染色试剂；其中，R1为C1-C10烷基链或芳香基团。
[0025]在本专利技术较佳的实施例中，上述方法的步骤(1.1.)中：搅拌时间为10-14h；所述第一有机溶剂为DMSO和DMF中的一种或两种组合，所述第一弱碱为碳酸钠、碳酸钾、磷酸钾和磷酸钠中的一种或多种组合；
[0026]步骤(1.2)中：在0℃充分搅拌后升温至60-80℃并搅拌过夜；
[0027]步骤(1.3)中：在室温下搅拌6-10h；所述第一还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾和氢化铝锂中的一种或多种组合，所述第二有机溶剂为甲醇、乙醇、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种组合；
[0028]步骤(1.4)中：在室温下搅拌5-7h；所述第三有机溶剂为二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或两种组合；
[0029]步骤(1.5)中：将所述溶液进一步冷却至-70～-80℃，搅拌时间为45-80min；所述第四有机溶剂为四氢呋喃和乙醚中的一种或两种组合，所述强碱为正丁基锂、仲丁基锂或叔丁基锂；
[0030]步骤(1.6)中：加入高锰酸钾之前，将体系温度冷却至0℃，然后加入高锰酸钾搅拌5-7本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种硅基罗丹明荧光染色试剂，其特征在于，具有式(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示结构：其中，R1为C1-C10烷基链或芳香基团。2.根据权利要求1所述的硅基罗丹明荧光染色试剂，其特征在于，所述罗丹明荧光染色试剂为：3.一种制备权利要求1所述的具有式(Ⅰ)的硅基罗丹明荧光染色试剂的方法，其特征在于，其包括以下步骤：(1.1)将间溴苯胺和1，4-二溴丁烷溶于第一有机溶剂中并加入第一弱碱加热搅拌，反应得到中间体A1；(1.2)在惰性气氛下将所述中间体A1加入至三氯氧磷和DMF的混合溶液中搅拌，然后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，得到中间体A2；
(1.3)将所述中间体A2和第一还原剂加入至第二有机溶剂中搅拌，然后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，得到中间体A3；(1.4)将所述中间体A1和所述中间体A3加入至第三有机溶剂，加入三氟化硼乙醚搅拌，反应得到中间体A4；(1.5)将所述中间体A4溶于第四有机溶剂并将溶液冷却至0℃以下，加入强碱，在搅拌下加入二氯二甲基硅烷，随后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，得到中间体A5；(1.6)将所述中间体A5溶于第五有机溶剂中，在搅拌下加入高锰酸钾继续搅拌，反应得到中间体A6；(1.7)将所述中间体A6溶于第六有机溶剂中，在搅拌下加入第二弱碱，再加入三氟甲磺酸酐，在搅拌下加入制得具有式(Ⅰ)的硅基罗丹明荧光染色试剂；其中，R1为C1-C10烷基链或芳香基团。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1.1.)中：搅拌时间为10-14h；所述第一有机溶剂为DMSO和DMF中的一种或两种组合，所述第一弱碱为碳酸钠、碳酸钾、磷酸钾和磷酸钠中的一种或多种组合；步骤(1.2)中：在0℃充分搅拌后升温至60-80℃并搅拌过夜；步骤(1.3)中：在室温下搅拌6-10h；所述第一还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾和氢化铝锂中的一种或多种组合，所述第二有机溶剂为甲醇、乙醇、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种组合；步骤(1.4)中：在室温下搅拌5-7h；所述第三有机溶剂为二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或两种组合；步骤(1.5)中：将所述溶液进一步冷却至-70～-80℃，搅拌时间为45-80min；所述第四有机溶剂为四氢呋喃和乙醚中的一种或两种组合，所述强碱为正丁基锂、仲丁基锂或叔丁基锂；步骤(1.6)中：加入高锰酸钾之前，将体系温度冷却至0℃，然后加入高锰酸钾搅拌5-7h；所述第五有机溶剂为丙酮和乙腈中的一种或两种组合；步骤(1.7)中：加入三氟甲磺酸酐之前，将体系温度冷却至0℃，然后加入三氟甲磺酸酐搅拌45-80min，加入后在室温下搅拌5-7h；所述第六有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈和DMF中的一种或多种组合，所述第二弱碱为吡啶、三乙胺和4-二甲氨基吡啶中的一种或多种组合。5.一种制备权利要求1所述的具有式(Ⅱ)的硅基罗丹明荧光染色试剂的方法，其特征在于，其包括以下步骤：(2.1)将6-溴吲哚溶于第七有机溶剂中在搅拌条件下加入碘甲烷和第一弱碱反应，得
到中间体B1；(2.2)将所述中间体B2溶于第八有机溶剂中并在搅拌条件下加入第二还原剂，得到中间体B2；(2.3)将所述中间体B2加入至三氯氧磷和DMF的混合溶液中搅拌，反应得到中间体B3；(2.4)将所述中间体B3和第一还原剂加入至第二有机溶剂中搅拌，反应得到中间体B4；(2.5)将所述中间体B2和所述中间体B4加入至第三有机溶剂，加入三氟化硼乙醚搅拌，反应得到中间体B5；(2.6)将所述中间体B5溶于第四有机溶剂并将溶液冷却至0℃以下，加入强碱，在搅拌下加入二氯二甲基硅烷，随后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷萃取，得到中间体B6；(2.7)将所述中间体B6溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：李坤，张宏，刘艳红，余孝其，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：