一种降解石油烃的表面活性菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种降解石油烃的表面活性菌株及其应用。该菌株为芽孢杆菌(Bacillus sp.)BBb，其保藏编号为CGMCC No.17504。本发明专利技术的表面活性菌株是从石油炼化车间的隔油池泥中提取出的含油污泥中筛选分离得到的，能够应用于降解含油污泥。本发明专利技术接种3％此菌株到pH为5-6，添加含油污泥做底物(初始浓度为3.6g L-1

【技术实现步骤摘要】
一种降解石油烃的表面活性菌株及其应用


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及一种降解石油烃的表面活性菌株及其应用。

技术介绍

[0002]随着经济的发展、社会的进步，工业生产对石油等化石燃料的需求日益增加，然而在油田的开采、炼制、运输、使用和储存的过程中会产生大量的含油污泥。含油污泥是一种含有大量的沥青质、重金属、病原菌、微量的放射性元素以及水、其他有机无机化合物牢固粘结在一起的乳化体系，会危害人体健康，影响动植物生长，污染土壤，破坏生态系统，同时也导致资源的浪费。近几年，我国含油污泥与炼化“三泥”的年产量已超过100万吨，且以每年3％以上的速度增长。2016版《国家危险废物名录》将石油石化工业产生的含油污泥划分为危险废物(HW08)，由含油污泥而引起的环境问题越发的显著。
[0003]目前国内外降解含油污泥的常用方法有溶剂萃取法、焚烧法、热解法、生物处理法等。然而溶剂萃取法的萃取剂需求量巨大，价格不菲，易于挥发，成本较高，限制了它在含油污泥处理中的应用。焚烧法能源利用率低，易造成二次污染，且石油资源没有回收再利用。利用热解法处理含油污泥能够实现油气回收和残渣回收利用，但热解法能量需求较大、运行成本较高。生物处理法主要通过微生物降解含油污泥。自然界中一些微生物能够分泌出特殊的表面活性剂，增强生物破乳特性，进而降解含油污泥。利用微生物降解含油污泥成本低、安全性强、无二次污染且利于生态修复。
[0004]目前对含油污泥降解菌的研究已有诸多报道。张恒等(陕北地区高效石油降解菌的筛选及其对油污土壤的修复研究，《延安大学学报》(自然科学版)2018年第3期)报道了从延安市延长县某油井的土壤样品中筛选出3株高效石油降解菌，分别为W1(假单胞菌属)、W3(芽孢杆菌属)、N4(红球菌属)，3种菌株在最适生长条件下对石油烃的降解率最高可达52.20％。李乐等(石油降解菌的筛选及复合菌群的构建，《当代化工》2018年第4期)从陇东油泥处理站的含油污泥中筛选分离得到5株高效石油降解菌，5株菌在最适生长条件下对石油烃的降解率为77.80％。由此可见，从含油污泥中可以筛选出具有一定降解石油烃能力的菌株。
[0005]本专利技术利用从含油污泥中筛选出的表面活性菌株，分泌特殊的表面活性剂，增强生物破乳特性，从而实现高效降解石油烃，本专利技术的降解石油烃的表面活性菌株，为生物法处理含油污泥提供了理论参考。

技术实现思路

[0006]本专利技术以石油石化工业产生的含油污泥为原料，从中筛选分离出能够高效降解石油烃的表面活性菌株，并提供利用所述菌株进行降解石油烃的方法。
[0007]本专利技术的一个目的是提供一种降解石油烃的表面活性菌株。
[0008]技术方案：本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0009]本专利技术所提供的菌株为为芽孢杆菌属Bacillus sp.，命名为BBb，其保藏编号为CGMCC No.17504。
[0010]本专利技术的菌株BBb，菌落形状为圆形，直径大约1-2mm，颜色为乳黄色，表面光滑，微微凸起，边缘光滑，生长快速。经过对该菌株的16S rDNA的鉴定与序列分析，表明该菌株为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，该菌株的核苷酸序列如Seq ID No：1所示。
[0011]该菌株BBb已于2019年4月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心(简称CGMCC，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其保藏编号：CGMCC No.17504，分类命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。
[0012]上述菌株是从含油污泥中筛选分离得到的。本专利技术含油污泥提取自石油炼化车间的隔油池泥。
[0013]本专利技术还提供了该菌株的分离方法，包括以下步骤：
[0014](1)称取风干后的含油污泥加入蒸馏水中，30℃、134r/min恒温振荡6h；静置后，吸取上层清液，按照倍比稀释法，依次制备10-2
、10-3
…
...10-8
稀释液；吸取稀释液进行涂布，30℃恒温培养3d后，挑取特征菌落进行平板划线分离纯化，将纯化的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面上，30℃恒温培养3d，4℃保存，每月继代一次；
[0015](2)将分离纯化出来的菌株接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃、150r/min恒温振荡培养，制成菌液；3d后，取培养后的菌液接种于添加石油烃做底物的液体牛肉膏蛋白胨培养基中，以下称作BBb液体培养基，接种量为3％，30℃、150r/min恒温振荡培养，设置3组重复；同时做空白对照实验，空白对照中加3％的无菌水；3d后测定以上BBb液体培养基中石油烃的含量，并分析其生物破乳特性；
[0016](3)经过反复的平板划线及石油烃去除效率、破乳能力的检验，最终得到所述的降解石油烃的表面活性菌株。
[0017]具体来说，该菌株的分离方法，包括以下步骤：
[0018](1)称取10g风干后的含油污泥加入27mL蒸馏水中，30℃、134r/min恒温振荡6h；静置后，用移液枪(枪头灭菌)吸取1mL上层清液，按照倍比稀释法，依次制备10-2
、10-3
…
...10-8
稀释液；后用移液枪吸取0.1mL稀释液进行涂布，30℃恒温培养3d，挑取特征菌落进行平板划线分离纯化；将纯化的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面上，30℃恒温培养3d，4℃保存，每月继代一次；
[0019](2)将分离纯化出来的菌株接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃、150r/min恒温振荡培养，制成菌液；3d后，取培养后的菌液接种于20mL添加石油烃做底物的液体牛肉膏蛋白胨培养基中，即BBb液体培养基，接种量为3％，30℃、150r/min恒温振荡培养，设置3组重复；同时做空白对照实验，空白对照中加3％的无菌水；3d后测菌液中石油烃的含量，并分析其生物破乳特性；
[0020](3)经过反复的平板划线及石油烃去除效率、破乳能力的检验，最终得到所述的降解石油烃的表面活性菌株。
[0021]所述BBb培养基中添加的底物石油烃提取自含油污泥。
[0022]所述底物石油烃的提取方法，包括以下步骤：
[0023](1)搅拌：对提取比例为10g风干后的含油污泥、50mL四氯化碳混合溶液进行搅拌2h(2000r min-1
)，使其充分溶解；
[0024](2)破乳：在混合液中添加6g NaCl，增强破乳特性；
[0025](3)离心：8000r/min离心15min；
[0026](4)过滤：通过0.45μm滤膜过滤；
[0027](5)滤液调pH至强酸性：收集滤液，用稀盐酸调节pH值至2左右以下；
[0028](6)旋转蒸发：滤液60℃旋转蒸发去除四氯化碳；
[0029](7)固相萃取：稀释后的粗提液流经固相萃取柱进行富集浓缩，并用四氯化碳梯
[0030]度洗脱；
[0031](8)氮气吹干：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种降解石油烃的表面活性菌株，其特征在于，所述菌株为芽孢杆菌属Bacillus sp.，命名为BBb，其保藏编号为CGMCC No.17504。2.根据权利要求1所述的降解石油烃的表面活性菌株，其特征在于，所述菌株从石油石化工业产生的含油污泥中筛选分离得到；所述含油污泥提取自石油炼化车间的隔油池泥。3.根据权利要求1或2所述的降解石油烃的表面活性菌株的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)称取风干后的含油污泥加入蒸馏水中，30℃、134r/min恒温振荡6h；静置后，吸取上层清液，按照倍比稀释法，依次制备10-2
、10-3
…
...10-8
稀释液；吸取稀释液进行涂布，30℃恒温培养3d后，挑取特征菌落进行平板划线分离纯化，将纯化的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面上，30℃恒温培养3d，4℃保存，每月继代一次；(2)将分离纯化出来的菌株接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃、150r/min恒温振荡培养，制成菌液；3d后，取培养后的菌液接种于添加石油烃做底物的液体牛肉膏蛋白胨培养基中，以下称作BBb液体培养基，接种量为3％，30℃、150r/min恒温振荡培养，设置3组重复；同时做空白对照实验，空白对照中加3％的无菌水；3d后测定以上BBb液体培养基中石油烃的含量，并分析其生物破乳特性；(3)经过反复的平板划线及石油烃去除效率、破乳能力的检验，最终得到所述的降解石油烃的表面活性菌株。4.根据权利要求3所述的降解石油烃的表面活性菌株的分离方法，其特征在于，所述BBb液体培养基中添加的底物石油烃提取自含油污泥。5.根据权利要求4所述的降解石油烃的表...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小梅，邢献杰，吴阳，于鑫娅，薛静静，彭明国，张文艺，
申请(专利权)人：中国石油化工股份有限公司，
类型：发明
国别省市：