一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶及其制备方法，属于生物医学工程技术领域。所述水凝胶材料是含有包含人脐带间充质干细胞外泌体，纳米羟基磷灰石，透明质酸‑己二酸二酰肼衍生物和主链具有醛基的海藻酸衍生物。其制备方法包含人脐带间充质细胞的分离、外泌体的提取、纳米羟基磷灰石制备、海藻酸钠透明质酸衍生物制备及复合水凝胶制备等步骤。本发明专利技术为骨缺损治疗提供了一种新的修复方法，具有广阔的应用前景和理想的修复效果。

【技术实现步骤摘要】
一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶及其制备方法
本专利技术涉及生物医学工程
，尤其是涉及一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶及其制备方法。
技术介绍
骨缺损修复是骨科领域研究的热点问题。临床上即使是常见的骨折，由于骨再生不良，大约有2％-10％的骨折可能进展为骨不连。而骨科临床医生也常常遇到诸如骨折、骨感染、骨肿瘤切除等原因造成的骨缺损的问题。此外，肥胖、糖尿病等导致骨骼肌肉疾病的增多和骨再生的减少，老龄骨质疏松患者骨折风险较高而骨再生能力不足。因此，如何促进骨骼再生，仍然是临床医生面临的主要挑战。以间充质干细胞为基础的骨组织工程技术为临床骨缺损再生修复带来了新希望。近期研究表明，干细胞衍生外泌体与干细胞具有相似的生物学效应，可以作为干细胞的替代物应用于骨组织修复，从而避免因直接使用干细胞而导致的突变致瘤、免疫排斥等诸多风险。目前利用外泌体来修复骨缺损的研究中，主要是将外泌体通过注射的方式来发挥作用，但是这种方法会导致外泌体在体内很快被清除，而骨修复又是一个长周期过程。因此，如何调控外泌体在骨缺损处的释放速率和释放周期，使其与新骨生长周期良好匹配，提高外泌体的生物利用度，从而达到最优的疗效是利用外泌体进行骨修复需要解决的关键问题。
技术实现思路
针对以上问题，本申请人提供了一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶。本专利技术选用海藻酸钠-透明质酸水凝胶作为载体，包裹外泌体注射到骨缺损部位，实现外泌体的控释与缓释，同时加入了纳米羟基磷灰石，从而进一步加强材料的机械性能和骨传导性。本专利技术的技术方案如下：一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶，其特征在于，所述复合水凝胶材料包含人脐带间充质干细胞外泌体，纳米羟基磷灰石(nHAP)，透明质酸-己二酸二酰肼衍生物(HA-ADH)和主链具有醛基的海藻酸衍生物(ALG-CHO)。进一步地，水凝胶中nHAP终浓度为5％(w/v)，HA-ADH终浓度为5％(w/v)，ALG-CHO终浓度为5％(w/v)，所含外泌体浓度为150ug/ml。进一步地，其制备方法有以下步骤：(1)脐带间充质干细胞的分离培养；(2)脐带间充质干细胞的成骨诱导：取培养至第三代步骤(1)中的细胞继续培养，当细胞密度达70％时换用成骨诱导培养基继续培养。(3)外泌体提取：取步骤(2)中成骨诱导2天后的细胞培养上清，在4℃条件下300g离心10min，2000g离心10min，10000g离心30min去除死细胞和细胞碎片，随后用0.22um滤膜过滤培养基，进一步在4℃，100000g条件下离心2小时。所得白色沉淀即为外泌体，将其溶解至PBS中于-80℃冰箱中保存。(4)nHAP制备：将硝酸钙溶解在去离子水中，加入柠檬酸钠，搅拌至完全溶解后用氨水调节溶液pH值，得到溶液A；将磷酸氢二铵溶解在去离子水中得到溶液B；随后启动超重力旋转填充床(RPB)，调节转速，将A、B两种溶液分别输送到RPB中反应生成的浆料产物经过离心、洗涤、真空干燥后得到nHAP。(5)HA-ADH制备：将透明质酸溶于去离子水中，溶解后加入己二酸二酰肼(ADH)并搅拌均匀，后向溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)催化反应，随后用HCl调节溶液pH，室温反应12h后，用去离子水透析，冷冻干燥得HA-ADH。(6)ALG-CHO制备：将海藻酸钠溶解到去离子水中，将高碘酸钠溶解于去离子水中，室温下反应24h，随后添加乙二醇终止反应，经过透析、冷冻干燥得到ALG-CHO。(7)复合水凝胶制备：称取nHAP分散于PBS溶液中，并加入HA-ADH至完全溶解，得到溶液1；称取ALG-CHO溶解于含有外泌体的PBS溶液中得到溶液2；随后将两种溶液装入注射枪内，注射到缺损部位使用。进一步地，所述步骤(1)为：取近胎儿段脐带15cm，浸泡在含有10％青链霉素的PBS中，在超净台内取出放置培养皿内，PBS反复冲洗脐带，剥离外膜和脐血管，组织剪剪碎至1mm3大小组织块，移至离心管内，PBS离心洗涤，2500rpm离心5min。用a-MEM完全培养基重悬组织块，接种于细胞皿内，置于37℃、5％CO2培养箱内培养，第二日补加a-MEM完全培养基，以后每3天完全换液一次。当细胞生长达到70-80％融合时，0.25％胰酶消化5min，镜下观察细胞皱缩变圆即刻弃消化液，滴加完全培养基终止消化，按1∶3比例进行传代培养。进一步地，所述步骤(2)中成骨诱导培养基包含DMEM、胎牛血清、地塞米松、抗坏血酸、β-磷酸甘油、L-谷氨酰胺和双抗。进一步地，所述步骤(4)中硝酸钙质量为5g，溶解硝酸钙的去离子水体积为100ml，柠檬酸钠质量为0.4g，氨水为5mol/L，调节pH值为11，磷酸氢二铵质量为1.675g，溶解磷酸氢二铵的去离子水体积为60ml。进一步地，所述步骤(5)中透明质酸质量为1g，去离子水体积为200ml，ADH为12.5g，pH为4.75，透析时间为5天。进一步地，所述步骤(6)中海藻酸钠质量为2g，溶解海藻酸钠的去离子水体积为90ml，高碘酸钠质量为1g，溶解高碘酸钠的去离子水体积为10ml，乙二醇体积为2ml。进一步地，所述步骤(7)中nHAP、HA-ADH、ALG-CHO质量为150mg，溶解nHAP的PBS体积为1.5ml，溶解ALG-CHO的PBS含有外泌体的浓度为300ug/ml，体积为1.5ml。进一步地，所述一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶用于治疗颅颌面及其他部位的骨缺损。本专利技术的有益之处在于：1、操作方便，能够适应于体内复杂多变的骨缺损环境；2、可以为细胞提供三维支架，有利于细胞定殖及骨基质沉积；3、能够在骨缺损部位缓慢降解，且具有良好的外泌体缓释功能；4、其成功研制将为骨缺损患者带来更加高效的治疗方法，同时为组织工及再生医学等领域提供一种具有较好前景的修复方式。附图说明图1为人脐带间充质干细胞流式细胞仪鉴定结果。图2为外泌体鉴定结果，其中A为透射电镜图，B为NanoSight纳米粒径分析结果，C为WesternBlot结果。图3为本专利技术制得的水凝胶扫描电镜图。图4为外泌体体外缓释曲线。图5为水凝胶体内骨缺损修复实验HE染色结果，其中A为对照组，B为水凝胶组，NB代表新生骨。具体实施方式下面结合实施例和检测例，对本专利技术进行具体描述。实施例1人脐带间充质干细胞外泌体提取(1)脐带间充质干细胞的分离培养取近胎儿段脐带15cm，浸泡在含有10％青链霉素的PBS中，在超净台内取出放置培养皿内，PBS反复冲洗脐带，剥离外膜和脐血管，组织剪剪碎至1mm3大小组织块，移至离心管内，PBS离心洗涤，2500rpm离心5min。用a-MEM完全培养基重悬组织块，接种于细胞皿内，置于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶，其特征在于，所述复合水凝胶材料包含人脐带间充质干细胞外泌体，纳米羟基磷灰石(nHAP)，透明质酸-己二酸二酰肼衍生物(HA-ADH)和主链具有醛基的海藻酸衍生物(ALG-CHO)。/n

【技术特征摘要】
1.一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶，其特征在于，所述复合水凝胶材料包含人脐带间充质干细胞外泌体，纳米羟基磷灰石(nHAP)，透明质酸-己二酸二酰肼衍生物(HA-ADH)和主链具有醛基的海藻酸衍生物(ALG-CHO)。


2.根据权利要求1所述的一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶，其特征在于，其组成成分中，nHAP终浓度为5％(w/v)，HA-ADH终浓度为5％(w/v)，ALG-CHO终浓度为5％(w/v)，所含外泌体浓度为150ug/ml。


3.根据权利要求1所述的一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶，其特征在于，其制备方法包括以下步骤。
(1)脐带间充质干细胞的分离培养；
(2)脐带间充质干细胞的成骨诱导：取培养至第三代步骤(1)中的细胞继续培养，当细胞密度达70％时换用成骨诱导培养基继续培养。
(3)外泌体提取：取步骤(2)中成骨诱导2天后的细胞培养上清，在4℃条件下300g离心10min，2000g离心10min，10000g离心30min去除死细胞和细胞碎片，随后用0.22um滤膜过滤培养基，进一步在4℃，100000g条件下离心2小时。所得白...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨烁，张建军，朱彪，赵立升，付之光，温宁，
申请(专利权)人：温宁，
类型：发明
国别省市：北京;11