一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料及其制备方法技术

本申请公开了一种嗅鞘细胞‑透明质酸水凝胶复合材料及其制备方法，用于制备嗅鞘细胞‑透明质酸水凝胶复合材料，该嗅鞘细胞‑透明质酸水凝胶复合材料可应用于脊髓损伤组织的修复，且具有良好的修复效果。与传统的嗅鞘细胞相比，本申请的嗅鞘细胞‑透明质酸水凝胶复合材料能够有效地提高嗅鞘细胞的存活率，还能填补脊髓组织缺损并与周边组织整合，抑制炎症反应和胶质瘢痕形成，诱导神经纤维再生，能够一定程度地促进脊髓损伤后运动功能的恢复。

【技术实现步骤摘要】
一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料及其制备方法
本申请涉及组织工程
，尤其涉及一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料及其制备方法。
技术介绍
脊髓损伤是主要因外伤所致的疾患，常导致脊髓局部大量神经细胞死亡、纤维束断裂，造成患者损伤平面以下不同程度的感觉、运动及内脏功能障碍。针对脊髓损伤处神经纤维再生、通路重建及功能恢复，目前常用一种治疗方式是植入已经分化好的胶质细胞，例如嗅鞘细胞(olfactoryensheathingcells，OECs)，从而有利于神经的再生。嗅鞘细胞具有长突起，可修复原有损伤的神经元轴突，同时能分泌多种神经营养因子(如NGF、BDNF、GDNF)，可以为轴突再生提供适宜微环境，有利于神经的再生，改善脊髓损伤后的神经功能。目前，采用OECs治疗损伤脊髓，多数采用将嗅鞘细胞注射移植至机体损伤脊髓处的模式，但是，在实际的治疗过程中，脊髓损伤存在较大的组织坏死囊腔，使得植入的OECs缺乏细胞外基质支持以及缺乏血供和必要的生存微环境，因此，移植至损伤脊髓处的OECs在损伤区大量死亡，导致OECs对损伤脊髓治疗的效果欠佳，对轴突再生促进作用较小，对髓鞘形成及机体运动功能恢复也不明显。
技术实现思路
本申请提供了一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料及其制备方法，以解决现有的嗅鞘细胞在实际移植治疗过程中，存活率较低，对损伤脊髓的治疗效果欠佳的问题。本申请提供一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的制备方法，包括以下步骤：步骤S100，在ED的介导作用下，使HA与ADH进行交联反应，制得HA水凝胶；步骤S200，采用液氮梯度冷冻法，将HA水凝胶塑形成具有纵向多通道结构的HA水凝胶支架；步骤S300，采用NaIO4氧化法，将antiNgR连接到具有纵向通道结构的HA支架上，得到接枝antiNgR的HA水凝胶支架；步骤S400，将接枝antiNgR的HA水凝胶支架置于培养孔板内，调节其PH值至7左右，灭菌后，加入含胎牛血清的DMEM/F-12培养基，浸润24小时后，在培养基内接种经分离、培养得到的嗅鞘细胞，每隔一天更换一次培养基，培养5-7天后，制得嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料。可选地，步骤S100具体包括，(1)称取0.04gPLL，加入去离子水溶解，并调节其pH值至11左右；(2)在PLL溶液中缓慢加入0.2g透明质酸钠，充分搅拌至充分溶解后,加入1.4gADH，搅拌24h，调节该混合溶液的pH值至4.7左右，得到中间混合液；(3)将0.4gEDC先用去离子水溶解后，再逐滴加入上述得到的中间混合液中，充分搅拌至溶液渐成凝胶；(4)将上述凝胶用去离子水在超声波清洗器中清洗，清洗后，调节pH值至7，并置于零下80℃冰箱内预冻2h后置入冷冻真空干燥仪内冻干，得到HA水凝胶；(5)将冻干的HA水凝胶材料置于真空干燥器中备用。可选地，步骤S200具体包括，(1)将数个塑料吸管捆扎成一体，塑料吸管的下端采用保鲜膜封口，得到塑形模具；(2)将HA水凝胶注入塑形模具内，塑形模具周围用聚苯乙烯泡沫塑料严密环绕包裹，除去塑形模具下端的保鲜膜，使塑形模具中的HA水凝胶上下端暴露；(3)将注有HA水凝胶的塑形模具放入盛有液氮的保温壶中，进行梯度冷冻30min；(4)将注有HA水凝胶的塑形模具从保温壶中取出，转至冷冻真空干燥仪中进行干燥，干燥后，得到具有纵向多通道结构的HA水凝胶支架，将其放入真空干燥器中备用。可选地，步骤S300，具体包括，(1)取5mgantiNgR溶于10ml去离子水中，加入100mgNaIO4，轻微搅拌至充分溶解；(2)将上述混合液倒入透析袋中透析8-10h，每2h更换去离子水1次，除去未反应的NaIO4及其反应残留物，用滤菌器过滤，得到无菌的抗体溶液；(3)对制备得到的具有纵向多通道结构的HA水凝胶支架进行消毒灭菌，然后将其与无菌的抗体溶液混合，在超净工作台中反应24h，得到接枝antiNgR的HA水凝胶支架。可选地，步骤S400中，嗅鞘细胞的分离、培养过程具体包括：1)取新生的SD大鼠，用6％水合氯醛腹腔注射麻醉，取头颅浸入75％的乙醇中消毒3min；2)在无菌条件下，用眼科镊夹取嗅球，放入盛有PBS液的培养皿中，去除嗅球表面的毛细血管、软脑膜及嗅球内的白质，保留嗅神经层和嗅球颗粒层，将嗅神经层和嗅球颗粒层放入4℃预冷的含胎牛血清的DMEM/F-12培养基内，并用眼科剪将其剪成小组织块；3)加入胰蛋白酶消化液，转移至离心管内，置于37℃的CO2培养箱内消化15min后，加血清终止消化3min，1000r/min离心10min，弃去上清液；4)加入含含胎牛血清的DMEM/F-12培养基，悬浮离心彻底洗涤胰蛋白酶，弃去上清液后加入含胎牛血清的DMEM/F-12培养基悬浮培养，用移液管吹打小组织块，至小组织块分散成单细胞混悬液；5)将单细胞混悬液接种于玻璃培养瓶中，置于37℃的CO2培养箱中培养12小时；6)将玻璃培养瓶中未贴壁的单细胞混悬液转入新的玻璃培养瓶中，置于37℃的CO2培养箱中培养24小时；7)将细胞悬液以1×108L-1浓度接种于培养皿中，置于37℃的CO2培养箱中培养，培养期间，每3-5天半量换液1次，得到嗅鞘细胞。可选地，步骤S400中，嗅鞘细胞接种的浓度为1×109L-1。本申请还提供一种采用上述方法制备的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料。本申请提供了一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料及其制备方法，用于制备嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料，该嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料可应用于脊髓损伤组织的修复，且具有良好的修复效果。与传统的嗅鞘细胞相比，本申请的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料能够有效地提高嗅鞘细胞的存活率，还能填补脊髓组织缺损并与周边组织整合，抑制炎症反应和胶质瘢痕形成，诱导神经纤维再生，能够一定程度地促进脊髓损伤后运动功能的恢复。附图说明为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为HA水凝胶冻干后的大体形态及超微结构，其中，图1-A、图1-B为HA水凝胶冻干后的大体形态图，图1-C的比例尺Scalebar为100μm的HA水凝胶冻干后的微观结构图，图1-D为比例尺Scalebar：50μm的HA水凝胶冻干后的微观结构图；图2为HA水凝胶支架的外形及内部结构，其中，图2-A为HA水凝胶支架的外观形态，图2-B为HA水凝胶支架的的横断面微观形貌，图2-C为Scalebar：50μm的HA水凝胶支架的纵切面微观形貌，图2-D为Scalebar：100μm的HA水凝胶支架的纵切面微观形貌；图3为HA水凝胶支架上接枝的antiNgR的免疫荧光染色显示图；...

【技术保护点】
1.一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤S100，在ED的介导作用下，使HA与ADH进行交联反应，制得HA水凝胶；/n步骤S200，采用液氮梯度冷冻法，将HA水凝胶塑形成具有纵向多通道结构的HA水凝胶支架；/n步骤S300，采用NaIO4氧化法，将antiNgR连接到具有纵向通道结构的HA支架上，得到接枝antiNgR的HA水凝胶支架；/n步骤S400，将接枝antiNgR的HA水凝胶支架置于培养孔板内，调节其PH值至7左右，灭菌后，加入含胎牛血清的DMEM/F-12培养基，浸润24小时后，在培养基内接种经分离、培养得到的嗅鞘细胞，每隔一天更换一次培养基，培养5-7天后，制得嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料。/n

【技术特征摘要】
1.一种嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S100，在ED的介导作用下，使HA与ADH进行交联反应，制得HA水凝胶；
步骤S200，采用液氮梯度冷冻法，将HA水凝胶塑形成具有纵向多通道结构的HA水凝胶支架；
步骤S300，采用NaIO4氧化法，将antiNgR连接到具有纵向通道结构的HA支架上，得到接枝antiNgR的HA水凝胶支架；
步骤S400，将接枝antiNgR的HA水凝胶支架置于培养孔板内，调节其PH值至7左右，灭菌后，加入含胎牛血清的DMEM/F-12培养基，浸润24小时后，在培养基内接种经分离、培养得到的嗅鞘细胞，每隔一天更换一次培养基，培养5-7天后，制得嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料。


2.根据权利要求1所述的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的制备方法，其特征在于，步骤S100具体包括，
(1)称取0.04gPLL，加入去离子水溶解，并调节其pH值至11左右；
(2)在PLL溶液中缓慢加入0.2g透明质酸钠，充分搅拌至充分溶解后,加入1.4gADH，搅拌24h，调节该混合溶液的pH值至4.7左右，得到中间混合液；
(3)将0.4gEDC先用去离子水溶解后，再逐滴加入上述得到的中间混合液中，充分搅拌至溶液渐成凝胶；
(4)将上述凝胶用去离子水在超声波清洗器中清洗，清洗后，调节pH值至7，并置于零下80℃冰箱内预冻2h后置入冷冻真空干燥仪内冻干，得到HA水凝胶；
(5)将冻干的HA水凝胶材料置于真空干燥器中备用。


3.根据权利要求1所述的嗅鞘细胞-透明质酸水凝胶复合材料的制备方法，其特征在于，步骤S200具体包括，
(1)将数个塑料吸管捆扎成一体，塑料吸管的下端采用保鲜膜封口，得到塑形模具；
(2)将HA水凝胶注入塑形模具内，塑形模具周围用聚苯乙烯泡沫塑料严密环绕包裹，除去塑形模具下端的保鲜膜，使塑形模具中的HA水凝胶上下端暴露；
(3)将注有HA水凝胶的塑形模具放入盛有液氮的保温壶中，进行梯度冷冻30min；
(4)将注有HA水凝胶的塑形模具从保温壶中取出，转至冷冻真空干燥仪中进行干燥，干燥后，得到具有纵向多通道结构的HA水凝胶支架，将其放入真空干燥器中备用。

【专利技术属性】
技术研发人员：文玉军，贾桦，王登科，牛建国，王峰，张莲香，顾金海，和祯泉，
申请(专利权)人：宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：宁夏;64